1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3094 2018 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范 The technical specifications for removing european genotype porcine reproductive and respiratory syndrome in breeding pig farm 2018 - 12 - 25 发布 2019 - 01 - 25 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3094 2018 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3
2、 术语和定义 . 1 3.1 欧洲型猪蓝耳病 . 1 3.2 可疑感染猪群 . 1 3.3 假定健康猪群 . 1 4 净化群的建立 . 1 4.1 采样数量和采样时间 . 1 4.2 检测方法 . 2 4.3 处理 . 3 5 净化群的维持 . 4 5.1 日常检测 . 4 5.2 后备猪的检测 . 4 5.3 引进猪只的检疫 . 4 5.4 病死猪的检测 . 4 6 净化场的认定 . 4 7 净化场的维持 . 4 7.1 引进猪只的检疫 . 4 7.2 病死猪的检测 . 4 7.3 人员和车辆等物品的消毒 . 4 7.4 场内及舍内环境的消毒 . 5 7.5 无害化处理措施 . 5 7.6
3、杀虫防蝇灭鼠措施 . 5 附录 A（规范性附录） 附录 A . 6 DB21/T 3094 2018 II 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则并起草。 本标准由辽宁省畜牧兽医局 提出并归口。 本标准起草单位：锦州医科大学 、辽宁省动物卫生监测预警中心、锦州市动物疫病预防控制中心等 单位。 本标准主要起草人： 李冰 、 刘全、 高慎阳、刘英姿、 陈勇、李宁、张建平、马强、赵岩、田苗、张 娜、夏伟、邵奎龙、路畅、李红伟、郭雪峰、孙洪广、刘宏艳、李强、刘晓宇、王军、徐畅、何礼。 DB21/T 3094 2018 1 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范 1 范围 本标准规定了种猪场欧
4、洲型猪蓝耳病净化的术语和定义、检测方法与判定标准、净化群的建立、净 化群的维持、净化场的认定和净化场的维持。 本标准适用于种猪场欧洲型猪蓝耳病净化工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27517 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株 复合 RT-PCR方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 3 术语和定义
5、3.1 欧洲型猪蓝耳病 欧洲型猪蓝耳病（ European Genotype Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ； EU-PRRS）：由欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 引起 猪 的 一种 高度接触性传染病， 该病 不但引起猪只免 疫抑制，母猪流产，也可引起仔猪死亡，同时影响高致病性猪蓝耳病的防控工作 ， 是 世界上危害 养猪业 最严重的传染病之一。 3.2 可疑感染猪群 可疑感染猪群（ Suspiciously infected swine herd）：未发现任何症状，但与患病猪群及其污染 的环境有过明显接触的猪群，称为可疑感染猪群。 3
6、.3 假 定健康猪群 假定健康猪群（ Hypothesis of healthy swine herd）： 除了患病 猪群 和可疑感染 猪群 外 ， 疫区其 他易感 猪群 都属于假定健康 猪群。 4 净化群的建立 4.1 采样数量和采样时间 4.1.1 假定健康猪群 DB21/T 3094 2018 2 种公猪按 100%比例采血，或同时按 100%比例采集精液，连续采集 2次，间隔 14天。种母猪按 25%比例 采血，或同时采集活体扁桃体，连续采集 2次，间隔 14天。 4.1.2 可疑感染猪群 种公猪、种母猪分别按 100%比例采血，或同时按 100%比例采集精液，连续采集 2次，间隔 1
7、4天。 4.1.3 感染猪群 种公猪、种母猪、后备猪分别 按 100%比例采血，或同时按 100%比例采集精液，连续采集 2次，间隔 14天。 4.2 检测方法 4.2.1 检测试剂和仪器 本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无 RNA酶的容器分 装，水为符合 GB/T 6682-1992标准 的灭菌双蒸水或超纯水。 本技术规范中需应用下列试剂和材料： Trizol（ RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中， 于 4 8 保存）、氯仿（ 4 预冷）、异丙醇（ 4 预冷）、 75%乙醇（用新开启的无水乙醇和 DEPC水 配制， 20 预冷）、 DEPC水（
8、 1000mL双蒸水中加入 1mL DEPC， 室温下持续搅拌过夜 ， 121 高压灭菌 25min）、 RNA酶抑制剂（ 40 U/L） 、 Taq DNA聚合酶（ 5 U/L） 、 dNTP(2.5 mmol/L)、 AMV反转录酶（ 5 U/L）、三羟甲基氨基甲烷 -乙酸电泳缓冲液（ TAE）、溴化乙锭（ EB）、 DL2000 DNA Marker、上游引 物： 5- TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3，下游引物： 5-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-3。 本技术规范中使用的 设备包括： PCR扩增仪，高速冷冻离心机 （离心力在 12000g以上
9、），核酸电泳 仪和水平电泳槽，组织均浆机或研钵，凝胶成像系统、微量移液器。 4.2.2 样品的采集与处理 4.2.2.1 组织样品 ：按照 GB/T 27517 标准中关于组织样品处理方法执行。 采集时应釆取有明显病变的 淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 0.5g 左右 于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨 ， 再加 0.3mL 0.5mL PBS 混匀 ， 然后将组织悬液转入无菌 Eppendorf 管中 ， 4 条件下 5000r/min 离心 10min， 取上清 液 转入新的无菌 Eppendorf 管中 ， 编号备用。 4.2.2.2 血
10、清或抗凝血 ： 用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉釆集血液 3mL 5mL， 待血清析出后直接吸 取 血清 至无菌 Eppendorf 管中 ，血清量不少于 0.5mL， 编号备用 ； 用无菌注射器先吸入抗凝剂 （ 阿氏液 ） 2mL 3mL， 再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液快速混匀后转入无菌 Eppendorf 管中 ， 编号备用。 4.2.2.3 存放与运送 ：采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。 采集或 处理的样品在 2 8 条件下保存应不超过 24h； 若需长期保存 ， 应放置 -70 冰箱 ， 但应避免反复冻 融。 4.2.2.4 RNA 提取及 cDNA
11、合成：按照 Trizol 提取试剂说明书提取总 RNA，按照反转录试剂盒说明书进 行转录合成 cDNA， 20保存待检。 4.2.2.5 RT-PCR 扩增 DB21/T 3094 2018 3 表 1 RT-PCR 反应体系（总体积 25L） 反应体系 最佳剂量 DEPC 水 13.5L 2.5 mmol/L dNTP 2L 10mol/L 上游引物 1L 10mol/L 下游引物 1L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5L 10 倍 PCR 缓冲液 2.5L 5U/L Taq DNA 聚合酶 0.5L cDNA 3L 总体积 25L 反应条件：预变性 95 3min；变性 94 30s
12、，退火温度 58 30s， 72 30s， 35个循环；总延伸 72 10min。 4.2.2.6 电泳：将 PCR 扩增产物 8L 与 2L 上样缓冲液混合，加样于 1%琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝 胶板一侧点样孔加入 DL2000 Mark DNA 分子质量标准物。以 5V/cm 电压电泳 30min，用紫外凝胶成像 仪观察结果。 4.2.2.7 结果判定 被检样品电泳出现 519bp 扩增带为欧洲型 PRRSV 阳性，详见图 1。 图 1 欧洲型 PRRSV 阳性毒株 PCR 电泳图 注： M, DNA分子量标准（ DL2000 Marker）； 1, 阴性对照； 2, PRRSV欧洲型毒株
13、阳性对照。 4.3 处理 欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测阳性者，应淘汰处理。在最后 1头阳性猪淘汰后 3个月，对种公猪按 100% 比例、母猪按 25%比例采血或同时按相同比例采集活体猪扁桃体样品，再次进行欧洲型猪蓝耳病病毒核 酸检测。 欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测全部阴性，可视为假定欧洲型猪蓝耳病阴性猪群。 DB21/T 3094 2018 4 5 净化群的维持 5.1 日常检测 每年对假定欧洲型猪蓝耳病阴性种猪群进行 3 4次抽检。每次采集血清或活体扁桃体样品，抽样比 例为存栏种猪的 25% 35%。应在连续 12个月内，对所有 6月龄以上种猪每头至少进行 1次欧洲型猪蓝耳病 病毒核酸检测，检测
14、方法按本技术规范建立的方法执行。 抽样复查如欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测出现阳性，应重新对种猪群开展净化，确保种猪群欧洲型 猪蓝耳病病毒核酸阴性。 5.2 后备猪的检测 选留的后备猪在转入种猪群前，进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测，确保转入种猪群的猪只欧洲型 猪蓝耳病病毒保持阴性，样品采集、检测方法及处置同 4.1、 4.2和 4.3检测方法。 5.3 引进猪只的检疫 对引进猪 只严格进行检疫、隔离，确保引进猪只没有欧洲型猪蓝耳病病毒感染和带毒，检疫方法按 4.1、 4.2和 4.3执行。 5.4 病死猪的检测 收集病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿，进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测，检测方
15、 法同 4.2。如若检出欧洲型猪蓝耳病病毒核酸阳性，应重新对种猪群开展净化。 6 净化场的认定 种猪场应符合下列所有条件，即达到欧洲型猪蓝耳病净化标准。 1) 种猪场连续 12 个月对所有 6 月龄以上种猪至少进行 2 次病原学监测，监测结果为阴性。 2) 有监测证据表明在过去 12 个月内猪群没有出现欧洲型猪蓝耳病临床病例。 7 净化场的维 持 7.1 引进猪只的检疫 按照跨省调运乳用、种用动物产地检疫规程 (农医发 201033号 )规定引进猪只。建立专门隔离 饲养舍，严格检疫引进猪只。在种猪启运前对拟引进猪只逐头进行检测，确定欧洲型猪蓝耳病病毒核酸 检测阴性后方可启运引进，引进后隔离饲养
16、 45 60天，再经检测合格后方可混群饲养。 7.2 病死猪的检测 7.2.1 收集病死猪及母猪所生产的弱仔、死胎、流产胎儿，进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测，检测 方法按 4.2 执行，若病毒核酸检测出现阳性，应重新对种猪场开展净化。 7.2.2 若弱仔、死胎及流产胎儿按 4.2 方法检测病毒核酸，检测结果阳性 者，淘汰对应的亲本母猪， 并重新对种猪场开展净化。 7.3 人员和车辆等物品的消毒 DB21/T 3094 2018 5 控制人员出入，猪场门口和各猪舍门口应设立消毒池，定期更换消毒药水；进入猪场的车辆除过消 毒池消毒外，还应对车身进行喷洒消毒；饲养、管理等人员可采取淋浴、消毒液洗手、
17、紫外线照射衣物 等方式消毒；衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取浸泡、高压灭菌等方式消毒；一线饲养人员严禁 串舍，生产工具不得混用。 7.4 场内及舍内环境的消毒 场内应设置净道和污道，对场内道路和明沟可用 2%的氢氧化钠等碱性消毒剂消毒；猪舍在有猪的状 态下，要选用无刺激或刺激性小的消毒药 进行舍内环境消毒，平时预防一般 1周消毒 1 2次。 7.5 无害化处理措施 病死猪及母猪所生产的死胎、流产胎儿按 GB 16548的要求，粪便按 NY/T 1168的要求进行无害化处 理。 7.6 杀虫防蝇灭鼠措施 采用物理法（机械法）和药物法定期开展杀虫、灭鼠、防蝇工作。 DB21/T 3094 20
18、18 6 A A 附 录 A （规范性附录） A.1 %溴化乙锭（ EB）溶液 溴化乙锭 0.2 g 灭菌双蒸水 加至 20 mL A.2 电泳缓冲液（ 50 倍） A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（ EDTA）溶液（ pH8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g 灭菌双蒸水 80mL 氢氧化钠 调 pH至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100mL A.2.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷乙酸 )电泳缓冲液（ 50倍） 羟基甲基氨基甲烷（ Tris）（分析纯） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（ EDTA）溶液（ pH8.0） 1
19、00 mL 灭菌双蒸水 加至 1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.3 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级） 2 g TAE电泳缓冲液 4 mL 灭菌双蒸水 196 mL 微波炉中完全融化，加溴化乙锭（ EB）溶液 20L。 A.4 75%乙醇 无水乙 醇（分析纯） 750mL 灭菌 DEPC水 250mL A.5 灭菌 DEPC水 双蒸水 1 000mL DEPC 1mL DB21/T 3094 2018 7 用磁力搅拌器室温下持续搅拌过夜，分瓶包装后 121高压灭菌 25min。 A.6 上样缓冲液 溴酚蓝 0.2g，加双蒸水 10mL过 夜溶解， 50g蔗糖加入 50mL水溶解后
20、，移入已溶解的溴酚蓝溶液中， 摇匀定容至 100mL。 A.7 电泳缓冲液（ 1 倍） 电泳缓冲液（ 50倍） 10mL 灭菌双蒸水 490mL A.8 磷酸盐缓冲液（ 0.01mol/L， pH7.4， PBS） 氯化钠（ NaCl） 8.0g 氯化钾（ KCl） 0.2g 磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O） 2.9g 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2g 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至 1 000mL，调 pH至 7.4，高压消 毒灭菌 112 kPa 20min， 4冰箱保存。 A.9 阿氏液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.8g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42g 加蒸馏水至 100mL，溶解后调 pH值至 6.1， 69kPa 15min高压灭菌， 4冰箱保存。 _
