1、 ICS 67.060 B22 DB36 江西省地方标准 DB 36/ T 8852015 南方水稻黑条矮缩病毒 RT-PCR 检测技术规 范 Rule of RT-PCR Detection on Southern Rice Black-streaked Dwarf Virus 2015 - 12 - 21 发布 2016 - 03 - 15 实施 江西省质量技术监督局 发布 DB36/ T 8852015 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 术语和定义 . . 1 3 样品采集 . . 1 4 样品处理 . . 2 5 总 RNA 提取 . . 2 6 RT-PCR
2、. 2 7 琼脂糖凝胶电泳 . . 2 8 凝胶成像分析 . . 2 附录 A（资料 性附录） 南方水稻黑条矮缩病病原 .3 附录 B（规范性附录） TRIzol 法提取总 RNA 技术流程 . . 4 附录 C（规范性附录） SRBSDV 标准样品 RT-PCR 电泳图 . . 5 DB36/ T 8852015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由江西省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西农业大学农学院。 本标准主要起草人：杨迎青、兰波、李湘民、崔汝强、孙晓棠、魏洪义、蒋军喜、陈洪凡、王广利、 熊艳。 DB36/
3、T 8852015 1 南方水稻黑条矮缩病毒 RT-PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice bl ack-streaked dwarf virus, SRBSDV）的 样品采集、样品处理、总RNA提取、RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析。 本标准适用于水稻疑似病株及白背飞虱样品对 SRBSDV的 RT-PCR检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 引物 primer 指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复 制的起始点，在核酸合成反应时， 作为每个多核苷酸链进行延 伸的出发点而起作用的多核苷酸链。 2.2 退火
4、温度 annealing temperature 为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。 2.3 反转录PCR reverse transcription PCR (RT-PCR) 指一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 2.4 琼脂糖凝胶电泳 agarose gel electrophoresis 指用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。 3 样品采集 3.1 水稻疑似病株样品采集 田间将疑似病株连根拔起，用吸水纸包住根部，整株带回实验室，保存于4冰箱、备用。 3.2 灯下白背飞虱样品采集 收集测报灯下的
5、白背飞虱，保存于4冰箱、备用。 3.3 田间白背飞虱样品采集 DB36/ T 8852015 2 在发病田块采用盘拍法采集白背飞虱样品，4冰箱保存、备用。 4 样品处理 4.1 疑似病株样品处理 取疑似病株叶片组织100 mg，置于研钵中，加液氮研磨至粉末状。 4.2 白背飞虱样品处理 取单头白背飞虱，置于2 mL离心管中，用牙签捣碎成匀浆。 5 总 RNA 提取 用TRIzol试剂或试剂盒提取疑似水稻病株及白背飞虱样品的总RNA，TRIzol法提取流程详见附录B， 试剂盒提取方法按照相应说明书进行。 6 RT-PCR 以实验室保存的标准SRBSDV总RNA为阳性对照，以健康水稻叶片总RNA为
6、阴性对照，采用特异性引物 S10-oF（5 -CGCGTCATCTCAAACTACAG-3） 和S10-oR （5 -TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3)对待测样品进行检测。 反应在15 L体系中进行，各组分如下：21 Step Buffer 5 L、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.4 L、上下游s10-of/ s10-oR各1 L、Total RNA模板 1 L，加RNase Free ddH 2O至15 L。 扩增程序：50反应30 min；94预变性3 min；94 变性30 s，52退火30 s，72延伸1 min， 30个循环；72延伸10
7、min。 7 琼脂糖凝胶电泳 取扩增样品5 L，加入1 L 6倍上样缓冲液（6 loading buffer），混匀，点样于1.0%的琼脂糖 凝胶（含0.05 L/ml EB或Goldview）上样孔中，用0.5 TBE缓冲液在5 V/cm8 V/cm电压条件下电泳 30 min。 8 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶从电泳槽中取出，置于凝胶成像系统下观察、拍照。并参照阳性对照条带大小，确定 待测样品是否携带SRBSDV。 DB36/ T 8852015 3 A A 附 录 A （资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病原 南方水稻黑条矮缩病于2001年在我国广东省阳江市首次发现 ，其症状类似水稻黑条矮缩
8、病,田间调 查及室内传毒实验表明, 白背飞虱( Sogatella furcifera）是该病毒的主要传毒介体。 根据该病原病 毒粒体形态、所致水稻细胞病理学特征、自然寄主范围、传毒昆虫种类及其传毒特性、病毒基因组特性 及电泳图谱、病毒基因组S9及S10序列, 认为该病毒应为呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属 （ Fijivirus）第2组的一个新种, 并暂定名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)。 DB36/ T 8852015 4 B B 附 录 B （规范性附录） TRIzol 法提取总 R
9、NA 技术流程 B.1 取疑似病株组织 100 mg，置于研钵中，加液氮研磨至粉末状。或取单头白背飞虱，置于 2 mL 离心管中，用牙签捣碎成匀浆。 B.2 处理后的样品置于 2 mL离心管中，加入 1 mL TRIzol充分匀浆，室温静置 5 min。 B.3 如样品中含有较多杂质，28，12,000 r/m离心 5 min10 min，用移液器吸取上清，转 到一个新的 2 mL离心管中 (可选步骤) 。 B.4 加入 0.2 mL氯仿，剧烈振荡 15 s30 s，静置 2 min3 min。 B.5 4，12,000 r/ m离心 15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相
10、和一个中间 层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的 60。 B.6 小心吸取上清至一新的DEPC处理过的 1.5 mL EP管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相） ， 加入 0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10 min。 B.7 4，12,000 r/ m离心 10 min。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 B.8 弃上清，于沉淀中加入 75%乙醇（4冰箱预冷）1 mL，4，7 ,500 r/m离心 5 min，小心吸取 弃去上清。 B.9 室温放置 5 min10 min，充分干燥RNA沉淀。 B.10 加入适量（50 L100 L）DEPC （Rnase Free）H 2O溶解RNA（65促溶 10 min15 min） 。 B.11 取 2 L进行电泳，其余-80保存。 DB36/ T 8852015 5 C C 附 录 C （规范性附录） SRBSDV 标准样品 RT-PCR 电泳图 注： M：DL2000 DNA Marker；1-2： SRBSDV标准样品；3-4：健康稻株样品。 _
