1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35332019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of donkey, mule/hinny and horse derived materials in leather Real-time fluorescent PCR method 2019 - 03 - 21发布 2019 - 04 - 21实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 35332019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 .
2、 1 5 试剂或材料 . 1 5.1 试剂 . 1 5.2 材料 . 2 5.3 配制溶液 . 2 6 仪器设备 . 3 7 检测用引物和探针 . 3 8 试验步骤 . 3 8.1 样本制备 . 3 8.2 DNA 提取 . 3 8.3 实时荧光 PCR 反应 . 3 9 试验数据处理 . 4 9.1 PCR 有效性判定 . 4 9.2 检测结果分析和表述 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 4 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 . 5 附 录 B （资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列 . 7 DB37/T 35332019
3、II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东 宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。 本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、 郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。 DB37/T 35332019 1 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1 范围 本标准规定了驴、骡和马 3种动物皮张源性成分的实时荧光定性 PCR检测方法
4、。 本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3 种源性成分的定性检测。 本方法检出限为 0.5 %。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR 进程，
5、对未知模板进行定性或 定量分析。 3.2 Ct值 cycle threshold 每个实时荧光PCR 反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 根据核基因 CKM(creatine kinase of muscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探 针 ，采 用 TaqMan实时荧光 PCR技术进行扩增，根据 PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定动物皮张驴、 马和骡 3种动物源性成分。 5 试剂或材料 除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 DB37/T 35332019 2 5.1.1 氯化钠
6、（NaCl）。 5.1.2 浓盐酸（HCl ）。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（ Tris base）。 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠（ Na2EDTA2H2O）。 5.1.5 十二烷基硫酸钠（SDS ）。 5.1.6 蛋白酶冻干品。 5.1.7 异硫氰酸胍（GuSCN ）。 5.1.8 硅珠。 5.1.9 无水乙醇。 5.2 材料 5.2.1 驴、骡和马 3 种动物皮张源性成分实时荧光 PCR 定性检测试剂盒。 5.2.2 2TaqManMaster Mix：含有 Taq DNA 聚合酶（终浓度 1 U/20 L）、 Mg 2+ （终浓度 2.0 mmol/L）、 dNTPs（终浓度 0
7、.2 mmol/L）。 5.3 配制溶液 5.3.1 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0）溶液：称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用浓盐酸调节 pH 至 8.0，转 移 至 100 mL 容量瓶中 ,加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸 汽 压（ 121 ） 灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.2 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.4）溶液：称取 12.1 g Tris 置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用 浓盐酸调节 pH 至 6.4，转移至 100 mL 容量瓶中 ,加水定容至刻度， 1
8、03.4 KPa 蒸汽压（ 121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.3 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0 ）溶液：称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中，加 入 80 mL 水，用 10 %的氢氧化钠溶液调节 pH 至 8.0，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸气压（ 121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.4 10 % SDS：称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中，加水 定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。 5.3.5 5 mol/
9、L 氯化钠溶液：称取 29.22 g 氯化钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中， 加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（ 121 ）条件下灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.6 细胞裂解液（Lysis Buffer）：取 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0 ）20 mL， 0.5 mol/L 二水乙二 胺四乙酸二钠（ pH 8.0） 5 mL，5.0 mol/L 氯化钠 10 mL， 10 %十二烷基硫酸钠 5 mL，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。 5.3.7 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液：称取 0.2 g 蛋白酶冻干
10、品，加水溶解，转移至 10 mL 容量瓶中，加水 定容至刻度，分装后于-20 保存。 5.3.8 RNA 酶溶液：称取 1 g 冻干品 RNA 酶 A 溶解于 6 mL 无菌水中，于 100 加热 15 min，缓慢冷 却至室温，转移至 10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，分装成小份存于 -20 。 5.3.9 DNA 结合液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl（pH 6.4 ）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（ pH 8.0），然后再加入 4 mL Trition X-100 溶液（温度 60 ），转 移至 100 mL
11、容量瓶中，加水定容至刻度。 5.3.10 漂洗液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.4 ）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0 ），转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。 DB37/T 35332019 3 5.3.11 TE 缓冲液：量取 0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、 0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸 二钠（ pH 8.0）加入到容量瓶中，调节 pH 至 8.0，转移至 50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸汽压（121
12、）灭菌 20 min，降至室温， 4 保存备用。 6 仪器设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪： 4 通道以上。 6.2 电子分析天平：感量 0.1 mg 或 0.01 g。 6.3 离心机：最大离心力不小于 13 000 g。 6.4 振荡型恒温金属浴： 0 100 。 6.5 高压灭菌锅。 6.6 低温冰箱： -20 4 。 6.7 超净工作台。 6.8 微量移液器：100 L 1 000 L，10 L200 L， 2 L20 L，0.5 L10 L。 6.9 容量瓶：10 mL ，50 mL， 100 mL。 7 检测用引物和探针 内标质控引物探针序列和马属动物通用 PCR引物、驴和马
13、的特异性探针序列见附录A中表 A.1，引物 探针在序列中的位置参见附录B 。 8 试验步骤 8.1 样本制备 盐干皮或鞣制皮张在平整处边缘取约5 g，去除毛、脂肪，将试样在无菌水中浸泡20 min ，用无菌 水清洗 2次，剪成直径约 5 mm左右小块，使用液氮充分研磨成粉末。 8.2 DNA提取 8.2.1 称取试样 30 mg5 mg 于 2 mL 的离心管中，每个样品设立 2 个平行样，加入 400 L 的 DNA 提 取细胞裂解液、 10 L 蛋白酶 K 混匀， 56 水浴 2 h，期间轻微混匀 35 次。 8.2.2 于 12 000 g 离心 5 min，吸取上清液转至新的 1.5
14、mL 离心管中，加入硅珠悬浮液 10 L、DNA 结合液 800 L，充分混匀室温静置 5 min，8 000 g 离心 1 min，弃上清液。 8.2.3 加入 700 L 漂洗液，涡旋振荡悬浮 10 s， 8 000 g 离心 1 min，弃上清液。加入 700 L 的 70 % 乙醇洗涤， 8 000 g 离心 1 min 弃上清液，重复此步骤 2 次。 8.2.4 于 8 000 g 离心 30 s，吸走残余液体，室温干燥 10 min，至残余乙醇挥发干。 8.2.5 加入 50 L TE 缓冲 液溶解 DNA，加入 1 L RNA 酶溶液， 55 水浴 5 min，8 000 g ，
15、离心 1 min， 吸取上清液转移至新的离心管中，-20 保存备用。 8.2.6 紫外分光光度计检测提取的 DNA 浓度与纯度，测定 260 nm 和 280 nm 处吸光值 A260/A280，比值在 1.71.9 之间， DNA 浓度约为 0.1 ng/L50 ng/ L。 8.2.7 也可采用经验证等效的动物组织 DNA 提取试剂盒，按照使用说明书提取。 8.3 实时荧光PCR反应 DB37/T 35332019 4 8.3.1 试样实时荧光PCR检测 多重实时荧光PCR：将驴、马和骡进行多重实时荧光PCR ， PCR反应体系 中包括驴和马2 种动物源性的 特异探针，并加入内标质控体系。
16、PCR 反应体系见附录 A中表 A.2。 8.3.2 对照实时荧光PCR反应体系 每个PCR 反应设置 3次平行。在试样 PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照： a) 空白对照：以水作为空白对照； b) 阴性对照：以 3 种动物之外的动物基因组 DNA 为阴性对照； c) 阳性对照：将驴、马和骡 3 种动物基因组 DNA 等量混匀作为阳性对照。 8.3.3 实时荧光PCR反应体系配制 按照附录A 中表A.2 依次加入试剂，配制 PCR反应体系，混匀离心分装至PCR 反应管中，加入模板 DNA， 3 000 g离心 1 min，取出PCR 管，放入荧光定量 PCR仪中。 8.3.4
17、 实时荧光PCR反应程序 95 预变性 3 min； 95 变性10 s，62 退火延伸 35 s，40 个循环。 9 试验数据处理 9.1 PCR有效性判定 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明 PCR体系有效： a) 空白对照：无 FAM 和 JOE 荧光信号，或 Ct 值 40.0，有 CY5 质控探针的荧光信号，且 Ct 值 35.0； b) 阴性对照：无 FAM 和 JOE 荧光的 S 型扩增曲线，或 Ct 值 40.0，有 CY5 质控探针的荧光信号， 且 Ct 值35.0 ； c) 阳性对照：有 FAM、 JOE 和 CY5 荧光的 S 型扩增曲线，且 Ct 值35
18、.0 。 否则判定为 PCR无效。 9.2 检测结果分析和表述 9.2.1 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、JOE 荧光扩增曲线出现，若 Ct 值35.0，则判定样 品中检出相应的动物源性成分；若无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.2 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、JOE 荧光扩增曲线出现，但 35.0 Ct 值 40.0，则 需要重新提取 DNA 进行 PCR 反应。若再次扩增后的 Ct 值 40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成 分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.3 对样品检测结
19、果的判定，见附录 A 中表 A.3。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 防治污染的措施按GB/T 27403规定执行。 DB37/T 35332019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定 A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 实时荧光定性PCR 引物和探针序列见表A.1 。 表A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 引物探针名称 缩写 序列（5- 3） 扩增片段（bp） 通用引物- 上游 CKMF TCATCGTAGCATCGAGGGG 228 246 通用引物- 下游 CKMR AGCAGAGCAGGAAGGGAGTT 内标引
20、物- 上游 IMF AGACCACCAAATGCCCCTATC 140 内标引物- 下游 IMR CGAGATTGAGATCTTCTGCGAC 内标探针 IMP 5CY5-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3DAB 驴源性探针 Lv-P 5JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-3BHQ2 马源性探针 M-P 5FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-3DAB 内标序列 AGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACG
21、AAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAA CTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCG 注：通用引物CKMF/CKMR用于驴、马和骡3 种动物源性成分检测。 A.2 实时荧光PCR反应体系 实时荧光定性PCR 引物和探针序列见表A.2 。 表A.2 多重实时荧光PCR反应体系 试剂名称 组分名称 加量（L ） 终浓度 2TaqManMaster Mix 10 1 10 Primer Mix CKMF/R 2 0.50 mol/L IMF/IMR 0.10 mol/L 10 Probe Mix Lv-P（JOE
22、） 2 0.10 mol/L M-P（ FAM） 0.20 mol/L IMP（ CY5） 0.10 mol/L 内标质粒 1 10 -3 ng/L 基因组 DNA 模板 2 1.0 ng100 ng ddH2O 补至 20L A.3 对各种样品检测结果的判定 对各种样品检测结果的判定见表 A.3。 DB37/T 35332019 6 表A.3 实时荧光PCR定性检测方法各种实验结果的判定 FAM 荧光 JOE 荧光 CY5 荧光 结果判定 Ct35 Ct35 多重 PCR 体系 检出马源性成份 未检出驴源性成分或含 量低于检测界限 多重 PCR 体系 检出驴源性成分 未检出马源性成分或含 量
23、低于检测界限 多重 PCR 体系 检出骡源性成分 未检出驴、马及骡源性成 分或含量低于检测界限 多重 PCR 体系 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测 实际样品时只有 CY5 荧光检出，无 FAM、JOE 荧光检出，判定为未检出驴、马和骡 3 种动物 源性成分。 多重 PCR 体系 PCR 反应失败。注意以下几个方面后再次进行 反应。 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则 可能是样品 DNA 制备有问题，如样品中可能存 在抑制物等。 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常， 则可能是实验操作失败或试剂失活。 DB37/T 35332019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 目的基因
24、扩增靶标参考序列 B.1 马( Equus caballus) PCR产物序列（Genbank:JQ065978.1） 马( Equus caballus) PCR产物序列 （Genbank:JQ065978.1 ） TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAACAA CCGGATCTTTCAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACT CTGAAATGGGAATAC
25、TTTTCATACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCC B.2 驴（Equus asinus）PCR产物序列(Genbank:HQ336263.1) 驴（ Equus asinus） PCR产物序列 (Genbank:HQ336263.1) TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAATAA CTGGATCTTTTAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTA
26、GGCAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACT CTGAAATGGGAATACTTTTCGTACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCC B.3 内标质粒 内标质粒 TGCACTCCTCCTGCATATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGT CCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG TATTCCTTGGACACATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACGGTACCTTGCTTTAATCCTAAATGGCAAACTCC 注：下划线为引物位置，阴影部分为探针位置。 _
