1、ICS 65.020.30 B 43 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3980 2020 鸽子性别鉴定的 PCR 方法 PCR method for sex identification of pigeon 2020 - 06 - 08 发布 2020 - 07 - 08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3980 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：济南百准生物检验有限公司、山东农业大学。 本标准主要起草人：孙淑红、朱琦
2、、王方昆、孙建华、杨树青、王云、吴少鹏、张富友、朱建国、 鞠孜敬 、唐德宏 。 DB37/T 3980 2020 II 引 言 鸽子是一种单态性鸟，雌雄鸽外观差异很小，很难肉眼鉴定性别。 鸽子的繁殖方式为典型的“一夫 一妻”制，如果性别比例不当，不但影响鸽群的安宁，而且造成产蛋率下降等危害，给饲养管理和繁殖 育种增加困难。鸽子性别鉴定的方法有翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测等方法。随着分子生物学 的发展， PCR方法因具有快速、灵敏、简便及特异性强等特点而被越来越广泛地应用到动物性别鉴定和 性别控制，为保证畜产品质量、提高畜牧生产效率提供了高效可靠的技术支撑。 本标准规定了 PCR方法鉴别鸽
3、子的性别技术，具有准确性高、检测步骤精简、成本较低以及对鸽子 伤害较小等优点，在对国内数千份鸽子微量血样本进行性别 鉴定的基础上，制定了本标准。 DB37/T 3980 2020 1 鸽子性别鉴定的 PCR 方法 1 范围 本标准规定了鸽子性别鉴定的 PCR操作方法。 本标准适用于各种品类、各日龄鸽子的性别鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术
4、要求 NY/T 541 2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂或材 料 3.1 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验室用水均符合 GB/T 6682 二级水规定。 3.2 肝素钠：配制方法见附录 A.1。 3.3 TAE 电泳浓缩缓冲液：配制方法见附录 A.2。 3.4 琼脂糖：配制方法见附录 A.3。 3.5 雄性鸽子对照、雌性鸽子对照均为已知性别的鸽子全血 DNA 作为模板， -20 保存。 4 仪器设备 4.1 4 冰箱（温控范围 2 8 ）。 4.2 离心管（ 1.5 mL 2 mL）。 4.3 PCR 仪。 4.4 电泳仪（电压 90 V 120 V）。 4.5
5、凝胶成像仪。 4.6 高压灭菌锅（灭菌温度： 105 135 ；工作压力： 0.35 MPa）。 4.7 微量 移液器（ 2 L、 20 L、 200 L、 1 000 L）及配套吸头。 5 样品采集、储存及运输 5.1 按 NY/T 541 2016 规定进行采样。用无菌针头于鸽子爪处刺破皮肤，吸取 20 L 全血并与 3 L 5 L 肝素钠（参见附录 A.1）混合，编号。 5.2 样品采集和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。 5.3 采集的样品储存和运输，参见 NY/T 541 2016。 DB37/T 3980 2020 2 6 试验步骤 本实验具体实验操作符合 GB/T 19495
6、.2 转基因产品检测 实验室技术要求。 6.1 引物 参照参考文献（刘宏祥等， 2013），合成针对鸽子雌雄性别染色体 CHD基因的一对引物 (A1/A2)作为 鸽子性别鉴定的引物，引物序列参见附录 B。 6.2 PCR 扩增 6.2.1 PCR 反应总体积为 25 L，引物为 A1/A2，模板为采集的鸽子抗凝全血， PCR 反应体系参见附录 C。 6.2.2 PCR 反应条件为 95 5 min、 55 5 min 循环 2 次裂解红细胞，释放 DNA，然后 94 预变 性 5 min， 94 40 s、 50 30 s、 72 40 s, 循环扩增 31 次 , 最后 72 延伸 7 mi
7、n。同时设立 雄性和雌性鸽子的 DNA 为对照。 6.3 PCR 产物电泳 取 8 L PCR扩增产物，进行 1.2 %的琼脂糖凝胶电泳（ 120 V， 30 min 50 min）。电泳结束后， 在凝胶成像仪上观察结果，拍照并做好试验记录。 7 结果判定 7.1 试验成立条件 雄性对照的 PCR产物电泳后，在 600 bp的位置出现一条特异性的扩增条带，雌性对照 PCR产物电泳后 在 450 bp和 600 bp处均有扩增条带，试验结果成立。否则试验结果不成立。（见附录 D） 7.2 结果判定 雄性：检测样品 PCR产物电泳后，仅有 600 bp的一条带，则鸽子性别为雄性。 雌性：检测样品
8、PCR产物电泳后，有 450 bp和 600 bp的两条带，则鸽子性别为雌性 。 DB37/T 3980 2020 3 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 肝素钠抗凝剂 150 mg肝素钠粉末（ 150 U/mg）与 100 mL生理盐水混合溶解。 A.2 TAE电泳缓冲液 使用时将 50倍 TAE电泳浓缩缓冲液用去离子水 50倍稀释即可。 50倍 TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取 Tris碱 242 g去离子水溶解，加入冰醋酸 57.1 mL、 0.5 mol/L EDTA 100 mL，用 5 mol/L的 NaOH调 pH至 8.0，定容至 1 000 mL。 A.3
9、 1.2 %琼脂糖凝胶 称取 1.2 g琼脂糖，加入 100 mL TAE缓冲液中加热溶解，最后 加入适量核酸染料。 A.4 2 Taq Master Mix成分 Taq DNA Polymerase 0.1 U/ L MgCl2 3 mM dNTPs 0.4 mM 2PCR反应缓冲液 DB37/T 3980 2020 4 B B 附 录 B （规范性附录） PCR 引物序列 PCR引物序列见表 B.1。 表 B.1 PCR 引物序列 引物（ primer） 序列 (sequence) A1 5-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3 A2 5-GCCTCCTGTTTATTATAGA
10、ATTCAT-3 DB37/T 3980 2020 5 C C 附 录 C （资料性附录） PCR 反应体系 PCR反应体系见表 C.1。 表 C.1 PCR 反应体系 组分 体积 (L) 水 10.3 2Mix 12.5 上游引物 (25 moL/L) 1.0 下游引物 (25 moL/L) 1.0 模板 0.2 总体积 25 DB37/T 3980 2020 6 D D 附 录 D （规范性附录） PCR 检测结果电泳图 PCR检测结果电泳图见图 D.1。 说明： M为 DNA Marker DL； m为雌性对照； g为雄性对照； 1、 2、 4为雌性； 3、 5为雄性。 图 D.1 PCR 检测结果电泳图 _
