1、ICS 11.220B 41备 案 号 :38105-2013 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 894 2013猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Apx -ELISA抗 体检 测 方 法 Enzyme-linked immunosorbent assay to detect the antibody against Apx ofActinobacillus pleuropneumoniae 2013 -03- 14发 布 2013- 06-01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 8942013 I 目 次前 言 . II引 言 .III1 范
2、围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 缩 略 语 .14 检 测 原 理 .15 检 测 条 件 .26 检 测 材 料 .2 7 检 测 方 法 .28 结 果 判 定 .39 注 意 事 项 .3附 录 A . 4附 录 B . 6 DB42/T 8942013 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大
3、学 、 武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫 病 预 防 控 制中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 周 锐 、 金 梅 林 、 陈 焕 春 、 宋 念 华 、 董 晓 辉 、 金 卉 。 DB42/T 8942013 III 引 言猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 （ porcine contagious pleuropneumonia） 是 由 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 （ Actinobacilluspleuropneumoniae, APP） 引 起 的 一 种 猪 的 重 要 呼 吸 道 传 染 病 ， 以 纤 维 性
4、 、 出 血 性 、 坏 死 性 胸 膜 炎 和 肺 炎为 主 要 特 征 ， 多 呈 急 性 经 过 ， 导 致 感 染 猪 急 性 死 亡 。 急 性 感 染 耐 过 猪 或 隐 性 感 染 猪 会 影 响 日 增 重 ， 延 迟出 栏 时 间 。 本 病 呈 世 界 性 分 布 ， 是 危 害 养 猪 业 最 严 重 的 呼 吸 道 细 菌 性 传 染 病 之 一 。ApxIVA 是 APP 特 异 性 的 体 内 诱 导 抗 原 。 本 标 准 以 ApxIVA 重 组 蛋 白 为 抗 原 建 立 的 间 接 ELISA 抗体 检 测 方 法 ， 不 仅 适 用 于 APP 感 染 的
5、 特 异 性 诊 断 ， 而 且 可 以 用 于 区 分 APP 灭 活 疫 苗 或 ApxIV 基 因 缺 失疫 苗 免 疫 猪 与 自 然 感 染 猪 的 鉴 别 诊 断 。本 标 准 参 照 国 家 二 类 新 兽 药 “ 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 ApxIV-ELISA 抗 体 检 测 试 剂 盒 ” （ 2010 新 兽 药证 字 49 号 ） 的 质 量 标 准 及 其 使 用 说 明 书 制 定 ， 为 国 内 首 次 提 出 。 DB42/T 8942013 1 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Apx-ELISA 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定
6、 了 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Apx抗 体 的 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （ ELISA） 检 测 方 法 的 缩 略 语 、检 测 原 理 、 检 测 条 件 、 检 测 材 料 、 检 测 方 法 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 猪 血 清 中 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Apx 的 抗 体 的 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日
7、期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。兽 用 生 物 制 品 质 量 标 准 汇 编 （ 2010） 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Apx -ELISA抗 体 检 测 试 剂 盒 质 量 标 准 。GB/T 6682-2008 中 国 实 验 室 用 水 国 家 标 准 。3 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 标 准 。猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 Actinobacillus pleuropneumoniae APP胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 ApxIV 毒 素 的 A 蛋 白
8、 ApxIVA酶 联 免 疫 吸 附 试 验 Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA630 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值 OD630nm 值阳 性 对 照 孔 OD630nm 值 的 平 均 值 P 样 品 孔 OD630nm 值 S4 检 测 原 理ApxIVA 毒 素 是 APP 种 特 异 性 的 外 毒 素 ， 但 在 体 外 培 养 APP 时 并 不 能 够 检 测 到 ApxIVA 毒 素 ， 只有 在 感 染 猪 体 内 才 能 够 检 测 到 ApxIVA 毒 素 及 其 抗 体 ， 因 此 ， 通 过 检 测 猪 血 清 中 A
9、pxIVA 毒 素 的 抗 体 ，可 以 诊 断 猪 是 否 感 染 了 APP。APP 的 ApxIVA 抗 体 ELISA 检 测 技 术 是 利 用 被 检 样 品 中 的 抗 体 与 包 被 在 酶 标 板 上 的 ApxIVA 抗 原发 生 反 应 ， 然 后 通 过 洗 涤 把 未 结 合 的 抗 体 及 其 他 物 质 去 除 。 再 加 入 羊 抗 猪 IgG 酶 标 抗 体 ， 酶 标 抗 体 与抗 原 抗 体 复 合 物 结 合 ， 加 入 底 物 后 ， 底 物 被 酶 催 化 成 有 色 产 物 ， 产 物 的 颜 色 深 浅 与 样 品 中 抗 体 的 量 呈 正相
10、关 ， 故 可 根 据 OD 630nm值 判 定 被 检 样 品 中 ApxIVA的 抗 体 水 平 。5 检 测 条 件 DB42/T 8942013 2 5.1 环 境 温 度检 测 过 程 宜 在 室 温 （ 18 25 ） 进 行 。5.2 主 要 仪 器台 式 低 温 离 心 机 、 微 量 移 液 器 、 2 8 冰 箱 、 恒 温 箱 、 酶 标 检 测 仪 。6 检 测 材 料猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 重 组 ApxIVA 蛋 白 、 阳 性 对 照 血 清 、 阴 性 对 照 血 清 、 羊 抗 猪 IgG 酶 标 抗 体 、 96孔 酶 标 板 、 包 被 液
11、、 封 闭 液 、 样 品 稀 释 液 、 洗 涤 液 、 底 物 液 A、 底 物 液 B、 终 止 液 。 试 剂 的 配 制 见 附 录A。 7 检 测 方 法7.1 样 品 处 理取 待 检 测 猪 的 血 液 ， 待 血 液 凝 固 后 ， 以 4000 r/min 离 心 10 min， 收 集 血 清 。 也 可 采 集 血 液 ， 待 凝 固后 自 然 析 出 血 清 。 血 清 呈 淡 黄 色 ， 无 严 重 溶 血 。 具 体 血 液 采 集 与 样 品 处 理 注 意 事 项 见 附 录 B。7.2 包 被用 包 被 液 将 抗 原 （ 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌
12、 重 组 ApxIVA 蛋 白 ） 稀 释 到 工 作 浓 度 （ 6.25 g/mL） 加 入 酶标 板 孔 内 ， 每 孔 100 L， 37 孵 育 1 h 后 ， 再 置 2 8 ， 8 h 10 h。7.3 封 闭 取 出 抗 原 包 被 板 ， 弃 去 孔 中 包 被 液 ， 在 干 净 的 吸 水 纸 上 拍 干 。 每 孔 加 入 洗 涤 液 120 L， 静 置 3 min，弃 去 洗 涤 液 后 拍 干 ， 重 复 洗 涤 3 次 。 然 后 加 封 闭 液 ， 200 L/孔 ， 于 37 封 闭 2 h， 甩 干 封 闭 液 ， 自 然干 燥 。 于 2 8 保 存 （
13、 密 封 可 保 存 6 个 月 ） 。7.4 样 品 稀 释将 待 检 血 清 用 样 品 稀 释 液 按 1:40 的 比 例 稀 释 （ 195 L 样 品 稀 释 液 中 加 5 L 待 检 血 清 ） ， 对 照 血 清用 血 清 稀 释 液 按 1:4 的 比 例 稀 释 （ 180 L 样 品 稀 释 液 中 加 60 L 对 照 血 清 ） 。7.5 加 样将 稀 释 好 的 待 检 血 清 和 对 照 血 清 各 取 100 L 加 入 到 抗 原 包 被 板 的 孔 中 ， 待 检 血 清 作 1 孔 ， 阴 性 对照 和 阳 性 对 照 各 作 2 孔 ， 轻 轻 振 匀
14、 孔 中 样 品 （ 勿 溢 出 ） ， 置 37 下 孵 育 30 min。 7.6 洗 涤弃 去 96 孔 酶 标 板 孔 中 的 溶 液 ， 加 入 洗 涤 液 200 L/孔 ， 静 置 3 min 后 弃 去 洗 涤 液 ， 并 在 干 净 的 吸 水纸 上 拍 干 ， 重 复 洗 涤 5 次 。7.7 加 酶 标 抗 体 DB42/T 8942013 3 每 孔 加 酶 标 抗 体 100 L， 置 37 下 孵 育 30 min， 按 7.6 中 的 方 法 洗 涤 5 次 。7.8 加 底 物每 孔 先 加 底 物 液 A50 L， 再 加 底 物 液 B 50 L， 轻 轻
15、振 荡 混 匀 ， 室 温 （ 18 25 ） 避 光 显 色 10min。7.9 终 止 反 应每 孔 加 终 止 液 50 L， 轻 轻 振 荡 混 匀 ， 10 min 内 测 定 结 果 。7.10 测 定 吸 光 值在 酶 标 检 测 仪 上 于 630 nm 波 长 处 测 定 各 孔 的 OD 630nm值 。8 结 果 判 定结 果 成 立 的 条 件 ： 阳 性 对 照 孔 OD630nm值 均 0.8， 且 1.6； 阴 性 对 照 孔 OD630nm值 均 0.2。如 果 S P0.25， 判 为 阳 性 ； 如 果 S P0.25， 判 为 阴 性 。9 注 意 事 项
16、检 测 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施 ， 废 弃 物 做 无 害 化 处 理 （ 详 见 附 录 B） 。 DB42/T 8942013 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）试 剂 的 配 制A.1 酶 标 抗 体将 羊 抗 猪 IgG 酶 标 抗 体 （ Southern BiotechnologyAssociates（ SBA） 公 司 ） 用 样 品 稀 释 液 按 1:5000稀 释 ， 置 4 保 存 可 使 用 7 天 。A.2 包 被 液 碳 酸 钠 （ Na2CO3） 1.59 g碳 酸 氢 钠 ( NaHCO3) 2.93 g
17、加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.3 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 0.5 g蔗 糖 （ C12H22O11） 1.0 g加 洗 涤 液 至 100 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.4 样 品 稀 释 液 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 0.5 g加 洗 涤 液 至 100 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.5 洗 涤 液氯 化 钠 （ NaCl） 8.0 g氯 化 钾 （ KCl） 0.2 g磷 酸 氢 二 钠 ( Na 2HPO412H2O ) 2.9 g磷 酸 二 氢 钠 （ NaH2PO4） 0.2 g吐
18、温 -20（ Tween-20） 0.5 mL加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.6 底 物 液 A磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4） 14.60 g柠 檬 酸 （ C6H8O7） 9.33 g DB42/T 8942013 5 过 氧 化 脲 （ CH6N2O3） 0.52 g加 蒸 馏 水 至 1000 mL用 HCl调 pH值 至 5.0 5.4， 置 2 8 下 保 存 备 用 。A.7 底 物 液 B四 甲 基 联 苯 胺 （ TMB） 20 mg无 水 乙 醇 （ C2H6O） 10 mL加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下
19、避 光 保 存 备 用 。A.8 终 止 液 40%的 氢 氟 酸 ( HF ) 625 L加 蒸 馏 水 至 100 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。 DB42/T 8942013 6 BB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）注 意 事 项B.1 血 样 采 集 及 处 理 过 程 ， 应 进 行 无 菌 操 作 ， 防 止 样 本 因 污 染 发 生 变 质 。 存 放 血 样 的 容 器 应 无 菌 ， 可 使用 一 次 性 灭 菌 容 器 。B.2 血 液 自 然 凝 固 后 无 菌 分 离 血 清 装 入 灭 菌 离 心 管 或 小 瓶 中 ， 加 盖 密 封 后 置 2 8
20、下 冷 藏 保 存 。 每份 血 清 样 品 贴 标 签 并 写 明 编 号 、 采 集 地 点 、 免 疫 背 景 、 时 间 等 ， 以 便 通 过 抗 体 检 测 ， 做 出 追 溯 性 诊断 。 B.3 采 样 及 检 测 过 程 ， 应 穿 工 作 服 ， 戴 口 罩 和 一 次 性 手 套 。B.4 血 样 处 理 及 检 测 过 程 中 产 生 的 废 弃 物 应 放 入 专 门 的 废 弃 物 容 器 ， 废 弃 物 经 高 压 消 毒 后 按 有 关 规 定 处理 。B.5 应 符 合 病 原 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 管 理 条 例 的 其 它 生 物 安 全 技 术 要 求 。_ DB42/T8942013
