1、 ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18352014 基因 C 型鸭甲型肝炎诊断技术规范 2014 - 09 - 19 发布 2014 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18352014 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 临床诊断 . . 1 5 病毒分离 . . 2 6 聚合酶链式反应 . . 2 7 诊断结果判断 . . 4 8 废弃物无 害化处理 . . 4 附录 A（规范 性附录） 相关试剂配制 . 5 DB51/T 183
2、52014 II 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：张焕容、岳华、汤承、杨发龙、张斌、任玉鹏、王远微。 DB51/T 18352014 1 基因 C 型鸭甲型肝炎诊断技术规范 1 范围 本标准规定了基因C型鸭甲型病毒性肝炎的临床诊断、病毒分离和反转录聚合酶链式反应检测的技 术要求。 本标准适用于基因C型鸭甲型病毒性肝炎的诊断， 反转录聚合酶链式反应适用于基因C型鸭甲肝病毒 的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注
3、日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 兽医实验室生物安全技术管理规范（ 2003农业部公告第 302号）。 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 基因C型鸭甲肝病毒 Genotype C Duck Hepatitis A Virus 鸭病毒性肝炎（ Duck viral hepatitis, DVH ）是由三种血清型的鸭肝炎病毒（ Duck hepatitis virus, DHV）引起雏鸭的一种以肝脏病变为主的
4、急性、高度致死性和接触性传染病。三种血清型 DHV 之间不 发生交叉反应， 临床上最常见的为血清型 DHV， 又称鸭甲型肝炎病毒 ( Duck hepatitis A virus, DHAV)， 简称鸭甲肝病毒，为小 RNA 病毒科成员。根据基因组成差异， DHAV 分为基因 A 型、 B 型和 C 型 3 种基因型，分别对应传统血清型 DHAV， “台湾新型 ”和 “韩国新型 ”DHAV。目前在我国大陆流行的主 要是基因 A 型和 C 型 DHAV。由基因 C 型 DHAV 引起的 DVH 称为基因 C 型鸭甲型病毒性肝炎。 3.2 聚合酶链式反应 PCR 即聚合酶链式反应 (Polymer
5、ase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于体外大量 扩增特定的 DNA 片段。 4 临床诊断 4.1 临床症状 主要发生于 13 周龄以内的雏鸭，发病初期精神萎顿，废食，眼半闭呈昏睡状，以头触地，不久即 DB51/T 18352014 2 出现神经症状，运动失调，身体倒向一侧，两腿痉挛踢动，死前头向背部扭曲，呈角弓反张状，两腿伸 直向后张开。 4.2 剖检病变 肝脏肿大、质脆、色暗淡或发黄，表面有大小不等的出血斑点。 5 病毒分离 5.1 病料采集 无菌采集病鸭肝组织，冷藏尽快送检，如不能及时检测，应保存在 -20。 5.2 病毒分离 5.2.1 病料处理
6、 无菌采集病死鸭肝脏，按病料与灭菌生理盐水质量体积比 1:3匀浆，将匀浆置于 -40中反复冻融 3 次， 10000 r/min 离心 15 min，上清液加入 2000 U/mL 双抗， 37作用 30 min后用细菌滤器进行过滤除 菌，作为接种材料。 5.2.2 病料接种 尿囊腔接种 10日龄 12日龄鸭胚，每胚接种 0.2 mL，每个样品各接种 4枚， 37孵育，每天观察 3 次。 5.2.3 收毒 弃去 24 h内死亡鸭胚， 收集 24 h 120 h内死亡鸭胚胚体并与尿囊液混合匀浆后， 反复冻融 3次， 10000 r/min离心 15 min，取上清液盲传 3代，获得的病毒液 -2
7、0保存，作为被检材料。 6 聚合酶链式反应 6.1 主要设备 6.1.1 PCR 扩增仪 6.1.2 电泳仪、水平电泳槽 6.1.3 凝胶成像系统 6.1.4 冷冻高速离心机 6.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 6.1.6 高压蒸汽灭菌锅 6.1.7 恒温水浴锅 6.1.8 移液器（0.1 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、200 L1000 L） 6.2 主要试剂 6.2.1 引物（10 mol/L） 上游引物： 5- TCCAACAGGGTCAAAGC -3； 下游引物： 5- AACTACTACAAGTCTGCCACG -3。 引物扩增片段大
8、小为 194 bp。 DB51/T 18352014 3 6.2.2 RNA 提取试剂：Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC 水、P rimescriptTM RT 试剂盒。 6.2.3 PCR 反应试剂： Taq DNA 聚合酶 （5 U/L） 、 MgCl2（25 mmol/L） 、 dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L） 、 10PCR Buffer(无 Mg2+)。 6.2.4 STE 缓冲液（组成及配制方法见附录 A） 6.2.5 TAE 电泳缓冲液（组成及配制方法见附录 A） 6.2.6 6上样缓冲液（6Loadi ng Buffer） 6.2.7 琼脂糖（电
9、泳级） 6.2.8 核酸染料(Goldview) 6.2.9 DNA 分子量标准： 根据目的片段大小，使用 600 bp DNA Marker。 6.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 6.2.11 阳性对照：标准参考毒株作为阳性对照。 6.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 6.3 样本处理 6.3.1 组织样本：肝脏等组织样本，取 1 g 进行研磨，DEPC 水稀释至 200 L，用于 RNA 提取。 6.3.2 培养病毒液：取 200 L 分离培养的病毒液直接用于提取 RNA。 6.3.3 对照样
10、本 RNA 提取与检测样本处理方法相同。 6.4 RNA 提取方法 6.4.1 取200 L 的被检材料于 DEPC 处理过的 1.5 mL EP 管中，加入 800 L Trizol 试剂，反复吹打 混匀，室温静置 5 min，使细胞完全裂解。 6.4.2 加300 L 氯仿，剧烈振荡呈乳白色，充分混匀后，静置 5 min。 6.4.3 将 EP 管经 12000 r/min 4离心 15 min，管内溶液分为上层水相和下层无机相，RNA 即在上层 水相，小心吸取上层水相转移至另一个经 DEPC 处理过的 1.5 mL 的 EP 管中。 6.4.4 加等体积的异丙醇溶液沉淀 RNA， 轻轻上
11、下颠倒， 室温静置 10 min， 12000 r/min 4离心 10 min。 6.4.5 弃去上清液，加 1 mL75%的乙醇溶液轻轻洗涤沉淀，清除有机试剂，12000 r/min 4离心 5 min。 6.4.6 弃去上清液，室温干燥沉淀 5 min10 min，RNA 沉淀用 25 LDEPC 处理水充分溶解作为模板， -20条件下保存备用。 6.5 cDNA 的合成：将溶解的 RNA 按照反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA。 6.6 cDNA 的合成体系为 10 L：5 PrimescriptTM Buffer 2.0 L，PrimescriptTM RT Enzyme Mix
12、 0.5 L，Random 6 mers 1.0 L，RNA 2.0 L，Rnase Free H2O 4.5 L。混匀后放入 PCR 自动扩增仪 中进行反转录（RT）反应。 6.7 cDNA 的合成条件为：37 15 mi n，85 5 s，4 5 min。反转录后得到的 cDNA 置于 -20保 存。 6.8 PCR 扩增 6.8.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。 6.8.2 PCR 反应总反应体系 25 L，包括以下成份：10 PCR Buffer 2.5 L、MgCl2（25 mM）2 L、 dNTP（2.5 mM）2 L、TaqDNA 聚合酶（5
13、U/ L）0.125 L、上游引物（10 mol/L）1 L、下游引物（10 mol/L）1 L、水 14.375 L、cDNA 模板 2 L。 6.8.3 反应程序为：95 预变性 5 min；95 变性 45 s，58退火 45 s，72延伸 45 s，35 个循 环；72 延伸 10 min；反应完毕 4保存。 DB51/T 18352014 4 6.9 PCR 产物的电泳检测 6.9.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2% 琼脂糖凝胶（见附录 A）。 6.9.2 取5 L PCR 产物与 1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5 V/
14、cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 6.10 结果判定 6.10.1 阳性对照出现一条 194 bp 大小的条带，阴性对照不出现条带。 6.10.2 被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 194 bp 的条带判定为阳性（+）；被检样品的 PCR 产物 经电泳后不出现 194 bp 的条带判定为阴性（-）。 7 诊断结果判断 7.1 临床症状和剖检病变符合 4.1 和 4.2，则判为基因 C 型鸭甲型肝炎临床疑似病例。 7.2 临床症状和剖检病变符合 4.1 和 4.2，临床样品或病毒分离材料 RT-PCR 检测阳性，则判为基因 C 型鸭甲型肝炎阳性。 8 废弃物无害化处理
15、按 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。 DB51/T 18352014 5 附 录 A （规范性附录） 相关试剂配制 A.1 TAE电泳缓冲液（pH8.0） 50 TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50 TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 A.2 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2 g 1TAE 电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60左右时加入 5L 的核酸染料，混匀，均 匀倒板，厚度为 3 mm5 mm。 _ DB51/T 18352014
