1、 ICS 65.020.01 B 16 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24782018 植物检疫实验室常规检验技术 病毒 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24782018 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 试剂与材料 . 1 5 仪器与用具 . 2 6 取样及送样 . 3 7 检测方法 . 3 8 结果判定 . 3 9 样品保存 . 3 附录A（资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征 . 4 附录B（资料性附录） 李属坏死环斑病毒主要
2、症状特征 . 5 附录C（资料性附录） 烟草环斑病毒主要症状特征 . 6 附录D（规范性附录） 酶联免疫吸附测定法检验程序 . 7 附录E（规范性附录） RT-PCR检验程序 . 9 DB51/T 24782018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A、B、C为规范性附录，附录D、E为规范性附录，。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。 本标准起草人：万佳、宁红、邓亚岷、李刚、蒋辉、吴志平、郭迪金、李小松。 DB51/T 24782018 1 植物检疫实验室常规检验技
3、术 病毒 1 范围 本标准规定了植物检疫实验室病毒检验的原理、试剂与材料、仪器与用具、取样及送样、检测方法、 结果判定和样品保存。 本标准适用于植物检疫实验室病毒的检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15569 农业植物调运检疫规程 3 原理 病毒病一般根据病害症状很难确定病毒种类，采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断 标准进行检验鉴定。 4 试剂与材料 4.1 DASELISA 血清学检验试剂 除非另有说明，在本标准中
4、仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 包被抗体：病毒抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于 4 备用； b) 酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的病毒免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 冰箱保存备用； c) 包被缓冲液：取 2.93 g 碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59 g 碳酸钠（Na2CO3），用 1000 ml 蒸馏水 溶解，pH 值为 9.6，贮藏于 4 冰箱保存备用； d) PBST 洗涤液：取 1.15 g 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） 、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.2 g 无水磷 酸二氢钾（KH2PO4）、8.0 g 氯化钠（NaCl）
5、、0.5 ml 吐温-20 ，用 1000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 7.2； e) 样品提取缓冲液：取 20 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2.0 g 蛋清蛋白、1.3 g 无水亚硫酸钠 （Na2SO3）、0.2 g 叠氮化钠（NaN3）、0.5 ml 吐温20、8 g 氯化钠、0.2 g 磷酸二氢钠、 1.15 g 磷酸氢二钠、0.2 g 氯化钾，用 1000 ml 蒸馏水溶解，贮藏于 4 冰箱保存备用；。 f) 共轭物缓冲液：取 0.2 g 牛血清白蛋白，用 100ml PBST 缓冲液溶解，贮藏于 4 冰箱保存备 用； g) 底物：对硝基苯磷酸二钠； h) 底物缓冲液：取 0.1
6、g 氯化镁（MgCl2）、90.39 g 二己醇胺（CH2CH2OH）、19.82 g 二己醇胺 -HCl（CH2CH2OH-HCl），用 1 000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 9.8，贮藏于 4冰箱保存备用； DB51/T 24782018 2 i) 终止液：12 g 氢氧化钠（NaOH）溶于 100 ml 蒸馏水。 4.2 RT-PCR 检验试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶： 100 U/ l； b) 1 TAE 缓冲液：40 mM Tris-H Cl， 20 mM NaAc， 2 mM EDTA(
7、用冰醋酸调 pH 至 8.0)。 c) 5 RT 缓冲液：50 mM Tis-HCl pH7.5， 100 mM NaCl， 0.1 mM EDTA， 10 mM D TT， 0.01% NP-40，50%甘油； d) 10 PCR 缓冲液： 100 mM Tris-HCl (pH 8.3)， 500 mM KCl； e) MgCl2 25 mM； f) RNA 酶抑制剂： 10 U/ l； g) RT 增强剂； h) 无水乙醇（CH3CH2OH）； i) RL 裂解液； j) 去蛋白液； k) Taq 酶 2.5 U/ l； l) dNTP Mixture 10 mM； m) 双蒸水（ddH
8、2O）； n) 2-巯基乙醇（C2H6OS）； o) 液氮 （N2）； p) 相应病毒引物； q) 100 bp DNA ladder (1500 bp)； r) 溴酚蓝（C19H10Br4O5S）； s) 琼脂糖凝胶：称取 1.5 g 琼脂糖缓缓倒入 250 ml 三角瓶内，加入 100 ml 1TAE，在微波炉 中加热 1 min 溶解后，再加入 5 l Goldview 的生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶 板上，冷凝后小心拔出梳齿。 5 仪器与用具 主要仪器及用具包括： a) 聚乙烯微量滴定板 根据样品数量选用 48 孔和 96 孔两种规格。 b) 移液器 2 l10 l、10 l
9、50 l、10 l200 l、200 l1000 l 和 1 ml5 ml 五 种规格及配套吸头。 c) 电子天平 1/100 g，1/1000 g。 d) 恒温培养箱。 e) 台式高速离心机。 f) 酶联免疫检测仪。 g) 水平电泳仪。 h) 凝胶成像系统。 i) PCR 扩增仪。 j) 研钵 内径 60 mm80 mm。 k) 冰箱、超低温冰箱。 DB51/T 24782018 3 6 取样及送样 6.1 取样 调运检疫样品按照 GB 15569 中附录 D和附录E相关规定进行取样，产地检疫样品按照相应的检疫 性有害生物产地检疫技术规程规定的取样要求进行取样，疫情监测样品按照相应的检疫性有
10、害生物监测 防控技术取样要求进行取样。 6.2 送样 在调运检疫、产地检疫及疫情监测过程中，采集具有可疑症状的叶片、枝条、果实、种子等材料， 用纸袋包装，并注明采样地点、品种、GPS、采样人、采样时间等，在保证不腐烂的前提下及时送检。 7 检测方法 7.1 症状观察 观察样品有无异样，初步判断是否具有病毒的表现特征（见附录A、B、C）。 7.2 DASELISA 血清学检验 检验方法见附录D。如采用认可的试剂盒，按说明操作。 7.3 RT-PCR 检验 检验方法见附录E。如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8 结果判定 8.1 DASELISA 在阴性对照OD值0.1，且阳性对照OD值大于阴性对
11、照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照 OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带相应的被检病毒；否则判定为阴性反应，即样品不带相应的被 检病毒。 8.2 RT-PCR 在阴性对照、空白对照无扩增条带，且阳性对照出现被检病毒目标条带的前提下，样品RT-PCR产物 电泳结果与被检病毒目标条带长度一致，判定为阳性反应，即样品带被检病毒；否则判定为阴性反应， 即样品不带被检病毒。 9 样品保存 经检疫鉴定后的样品，应在-80 -20 冰箱保存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后， 需进行灭活处理。 DB51/T 24782018 4 AA 附 录 A （资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症
12、状特征 A.1 危害与症状 该病毒主要危害黄瓜、西瓜、南瓜和甜瓜等葫芦科作物。一般造成减产20%以上，严重的甚至绝收。 在西瓜叶片只产生轻微的斑纹和矮化，但在果实中却造成严重的变色或使果实内部造成腐烂，在黄瓜叶 片上出现色斑，水泡及变形，植株矮化，病株开花迟、少花，不结果或果畸形。 A.2 传播途径 该病主要通过种子进行传播，也可通过土壤、水、介体、农事操作和机械接触传播。 A.3 检疫措施 种植经检疫合格的健康种子，严禁发生区内的种苗外调；及时挖除发病植株，就地集中晒干焚烧； 播种前用310% 亚磷酸三钠浸种10分钟，发病田土壤和农具用100倍福尔马林处理后覆膜封闭5-7天；发 病田改种非葫
13、芦科作物两年以上。 DB51/T 24782018 5 BB 附 录 B （资料性附录） 李属坏死环斑病毒主要症状特征 B.1 危害及症状 该病毒几乎可侵染所有的李属植物，引起坏死、皱缩、花叶、环斑、穿孔、枯死等，特别在苗期发 生会造成严重损失。典型症状是新叶上出现坏死环斑或黄条斑，坏死斑中心脱落，出现孔洞，重者只剩 下花叶状叶架。 B.2 传播途径 该病毒主要通过种子和苗木传播，嫁接及农事操作也可传播。 B.3 检疫措施 种苗调运时实施检疫；建立无毒种苗繁育基地，发展无疫病优质果树生产区；选择抗病毒药剂进行 化学防治，重点进行药剂灌根和主干环剥涂药。 DB51/T 24782018 6 CC
14、 附 录 C （资料性附录） 烟草环斑病毒主要症状特征 C.1 危害及症状 该病毒主要为害烟草、番茄、马铃薯、大豆、西瓜、黄瓜等作物，可导致减产和产品质量下降。在 烟草叶片上产生环斑，病斑常由断续的坏死线局限起来，呈粉白色或棕色单环或双环，直径约58 mm， 与病斑相邻组织褪绿，有时形成一个晕圈。为害大豆，引起植株顶芽弯曲变褐枯死，其他侧芽变褐色， 茎和复叶叶柄产生褐色条纹，豆荚发育不良。 C.2 传播途径 该病毒主要通过种子传播，在田间主要靠汁液摩擦接触传播，病毒多通过叶片和根部伤口进入，昆 虫、线虫可造成植株伤口，并传播病毒。 C.3 检疫措施 实施严格的检疫制度，对寄主繁殖材料实施检疫；
15、珍贵寄主材料，可进行茎尖脱毒处理；药剂防治 传毒昆虫及线虫，可以减少病毒株间的传播；与非寄主作物轮作；利用基因调控在遗传育种上获得抗病 品种。 DB51/T 24782018 7 DD 附 录 D （规范性附录） 酶联免疫吸附测定法检验程序 D.1 包被抗体 D.1.1 包被 用包被缓冲液稀释病毒包被抗体，在所需反应孔中加入100 L。将酶联反应板置于保湿容器中，37 孵育4 h。 D.1.2 洗板 向每个反应孔中加入200 L PBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上 拍干。 D.2 点样 D.2.1 样品制备 将待测样品剪碎混匀后取其中1 g置于研钵中， 加入10
16、 ml样品提取液充分研磨后， 以一层薄棉布（或 类似细棉纱）过滤样品。在样品制备过程中应注意防止样品的交叉污染。 D.2.2 点样 用移液器将制备好的样品按每孔100 L加入酶联反应板孔内，每个样品重复一次，设置阳性对照、 阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，4 冰箱孵育过夜（至少 16 h）。剩余样品于-20 冰箱保存备查。 D.2.3 洗板 在每个反应孔加满PBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上拍干。 D.3 结合酶标抗体 D.3.1 加酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L用共轭物缓冲液按比例稀释的酶标抗体溶液。置于保湿容器中
17、37 孵育1 h。 D.3.2 洗板 同D.2.3，重复4次。 D.4 显色 DB51/T 24782018 8 每孔加入 100 L 底物溶液。25 避光孵育 1 h，至阳性对照显色。 D.5 终止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。记录检检测结果和酶联板反应原始照片，存档备查。 D.6 结果测定和记录 用酶联检测仪测定在405 nm光度下的吸光率（OD值）并记录。 DB51/T 24782018 9 EE 附 录 E （规范性附录） RT-PCR 检验程序 E.1 病毒模板RNA的制备 采用TIANGEN RNApre p Plant Kit试剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用
18、者，如果等效产 品具有相同效果，则可使用这些等效产品）提取病毒RNA。称取50 mg100 mg的叶片、茎杆或种子，在 液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷 的1.5 ml的E P管中，加入500 L的RL裂解液（使用前按RL 裂解液1 ml 加入2-巯基乙醇10 L），涡旋剧烈震荡5 min使其混匀。将匀浆液转移至CS过滤柱上，12000 rpm 离心2 min5 min，小心吸取上清液至无 RNA酶（RNase-free）的离心管中，吸头尽量避免接触收 集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清液0.5倍体积无水乙 醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入CR吸 附柱中，12000 rpm离心1 mi
19、n,弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700 L 去蛋白液RW1，12000 rpm离心1 mi n，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500 L漂洗 液RW，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在 12000 rpm离心2 min,，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free离心 管中，向膜中央加入50 L100 L无RNA酶的双蒸水，室温放置2 min，1200 0 rpm离心2 min，得到RNA 溶液。 E.2 RT-PCR扩增 E.2.1 反转录 E.2
20、.1.1 反应体系 RT反应体系见表E.1。 表E.1 病毒 RT 反应体系 反应物 模板 RNA 上游引 物 RNasin RT Ehancer 5 RT buffer dNTP MMLV 无RNA酶的 ddH2O 加入量（ L） 2.5 0.5 0.5 0.5 4 1 0.5 10.5 E.2.1.2 程序 反转录程序为：42 ，50 min；94 ，5 min；4 保存。 E.2.2 PCR反应 E.2.2.1 反应体系 PCR反应体系见表E.2。 E.2.2.2 反应程序 反应程序为：94 3 min；94 30 sec，59 30 sec，72 30 sec，30次循环；72 10
21、min； 4 保存。 DB51/T 24782018 10 表E.2 PCR 反应体系 反应物 10PCR Buffer dNTP 上游引 物 下游引 物 cDNA TaqDNA 聚合酶 MgCl 2 无RNA酶的ddH 2 O 加入量（L ） 2.5 0.5 1 1 4 0.5 1.5 14 E.3 扩增产物检测 E.3.1 琼脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L扩增反应物加0.5 L的溴酚蓝上样缓 冲液混匀，以及2 L 100 bp DNA ladder分别点入样 孔内。电泳缓冲液1TAE适量，100 V，电泳30 min。 E.3.2 结果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察并记录DNA条带有无和片段大小。 _ DB51/T 24782018
