1、ICS备案 号： 20481-2010青 海 省 地 方 标 准 DB63 DB63 DB63/T862 209实验室冬虫夏草真菌 -中国被毛孢 真菌分离技术规程 209-12-07发布 201-01-0实施青 海 省 质 量 技 术 监 督 局发布发布发布 发布 DB63/T862 2009 I 目 次前言 .II1范围 .12术语 .1 3分离 用培 养基 的制 备 .14冬虫 夏草 的采 收 .15冬虫 夏草 真菌 分离 的环 境要 求 .26冬虫 夏草 真菌 的分 离步 骤 .27分离 后的 培养 .28菌种 鉴定 .2 9分离 时的 注意 事项 .2 DB63/T862 2009 I
2、 前 言本规 程由 青海 省畜 牧兽 医科 学院 提出 并归 口。 本规 程由 青海 省畜 牧兽 医科 学院 草原 所负 责起 草。 本规 程起 草人 :李玉 玲、 刘欣 、马 少丽 、徐 海峰 、张 宗豪 。本规 程由 青海 省质 量技 术监 督局 批准 发布 。 DB63/T862 2009 1 实验室冬虫夏草真菌 -中国被毛孢真菌分离技术规程1范围 本规 程规 定了 实验 室冬 虫夏 草（ Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.）的 收集 、分 离的 环境 条件 、分离 的设 备、 分离 技术 等冬 虫夏 草真 菌的 分离 技术 措施 。 本规 程适 用于 实验 室冬
3、 虫夏 草真 菌 中国 被毛 孢的 分离 。2术语2.1 中国 被毛 孢（ HirsutellasinensisLiu,Guo,Yu&Zeng）指冬 虫夏 草的 无性 型。2.2分离 从冬 虫夏 草体 内分 离出 中国 被毛 孢的 过程 。2.3 消毒 是指 杀死 或消 除物 体表 面所 有病 原微 生物 的措 施。2.4灭菌 是指 用物 理或 化学 方法 将所 有致 病和 非致 病的 微生 物全 部杀 灭 的方 法。2.5 无菌 操作 指采 用经 过一 定消 毒措 施处 理之 后的 环境 、器 具及 人为 操作 的工 作方 式。2.6培养 基 是供 微生 物 、 植物 和动 物组 织生 长和
4、 维持 用的 人工 配制 的养 料， 一般 都含 有 碳水 化合 物 、含 氮物质、 无机 盐（ 包括 微量 元素 ）以 及 维生 素 和水 等。 有的 培养 基还 含有 抗菌 素 和 色素 。 3分离 用培 养基 的制 备3.1牛肉 汤的 制备先将 新鲜 牛肉 去除 筋和 脂肪 ，然 后取 1kg牛肉 加蒸 馏水 2kg放入 容器 内煮 沸， 煮沸 约 40min后将 肉渣滤 去， 肉水 经 121 、 0.1MPa高压 灭菌 30min后备 用。注： 煮沸 时应 边煮 边搅 动； 煮沸 前应 在容 器壁 上划 一刻 度， 煮沸 时随 时添 补蒸 馏水 。 3.2分离 用培 养基牛肉 汤 5
5、00ml、 牛 奶 200ml、 葡 萄 糖 30g、 琼 脂 18g、 水 解 乳蛋 白 5g、 酵 母 1g、 磷 酸 氢二 钾 1g、 核 糖 核酸 0.5g、硫 酸镁 0.2g、加 水定 容至 1000ml。3.3培养 基的 制备3.3.1量取 蒸馏水 300ml，按 上述 配方 加入 水解 乳蛋 、酵 母、 葡萄 糖、 磷酸 氢二 钾、 硫酸 镁、 核糖核酸 和琼 脂放 入容 器内 加热 煮沸 溶化 后备 用； DB63/T862 2009 2 3.3.2量取 牛奶 200ml加热 煮沸 后取 下备 用；3.3.3将上 述溶 液和 牛肉 汤共 同放 入容 器中 煮沸 后分 装于 试管
6、 中， 然后 至于 121 、 0.1MPa条件 下 灭菌 30min后备 用。4冬虫 夏草 的采 收4.1采收 时选 择虫 体饱 满、 子座 短小 的冬 虫夏 草， 冬虫 夏草 外包 裹的 土（ 菌） 鞘要 完好 。 4.2采收 的冬 虫夏 草当 天要 分离 。5冬虫 夏草 真菌 分离 的环 境要 求 分离 时要 将采 收到 的冬 虫夏 草带 回实 验室 ，在 无菌 条件 下进 行。 因路 途遥 远无 法带 回时 ，携 带便 携式 超净 工作 箱现 场进 行分 离。工 作 前先 将工 作环 境进 行彻 底消 毒 ，然后 在便 携式 超净 工作 箱内 进行 分离 。 6冬虫 夏草 真菌 的分
7、离步 骤6.1准备 工作6.1.1升汞 消毒 液的 配制准确 称取 0.1gHgCl 2加少 许蒸 馏水 溶解 后用 蒸馏 水定 容至 100ml。6.1.2消毒 灭菌6.1.2.1分离 工作 前用 有效 氯含 量为 1. 1.3的 消毒 液将 分离 环境 喷雾 消毒 。6.1.2.2将分 离用 的医 用手 术刀 、医 用小 剪刀 、接 种铲 、接 种针 、 9cm培养 皿用 柔性 较好 的纸 包扎好后 至于 121 、 0.1MPa条件 下灭菌 30min后取 出， 放入 超净 工作 台内 备用 。6.1.2.3将已 制备 灭菌 好培 养基 的试 管放 入超 净工 作台 内， 打 开超 净工
8、 作台 内的 紫外 灯， 照射 30min 后关 闭紫 外灯 的电 源。 6.2将采 收回 来的 冬虫 夏草 外包 裹的 土（ 菌） 鞘剥 离， 然后 用毛 刷洗 净冬 虫夏 草表 面的 泥土 ，用 流水清洗 干净 。 在超 净工 作台 内将 已洗 净的 冬虫 夏草 放入 升汞 消毒 液灭菌 5min后取 出， 用无 菌蒸 馏水 冲冼 三次后备 用。 6.3在超 净工 作台 内取 一根 冬虫 夏草 放置 在无 菌的 培养 皿中 ，用 医用 手术 刀切 去冬 虫夏 草的 外表 皮， 选取 里面 的白 色菌 丝组 织块 ，将 组织 块放 入另 一个 无菌 的培 养皿 内切 碎至 碎粒 状。 6.4
9、在超 净工 作台 内的 酒精 灯下 ，用 接种 铲将 碎粒 状组 织块 接种 至试 管中 ，盖 上棉 塞后 放入 培养 箱中培养 。 7分离 后的 培养 将接 种好 的试 管放 入恒 温培 养箱 中， 在 18 条件 下培 养。 8菌种 鉴定 该菌 培养 7d后， 在接 种组 织周 围出 现辐 射状 沟纹 突起 ；培 养 10d 15d出现 白色 细毛 状菌 丝； 30d后形成 灰白 色光 滑的 菌苔 ，气 生菌 丝不 发达 ，下 面菌 丝开 始伸 入培 养基 中； 60d后形 成茸 状圆 形的 菌落 ；90d菌落 直径 可达 1.5cm 2.5cm，菌 落突 起呈 馒头 状， 表面 不平 ，
10、灰 白色 至棕 黄色 ，菌 落坚 硬， 伸入 培养基 中的 菌丝 呈棕 黑色 ， 同 时 有棕 黑色 色素 向外 围扩 散， 菌 丝 体具 鲜香 菇气 味； 培 养 120d 150d开始 产 生分 生孢 子。 镜检 观察 时可 见分 生孢 子顶 生、 肾形 ，着 生在 分生 孢子 梗顶 端， 分生 孢子 颜色 为黄 褐色 。9分离 时的 注意 事项 DB63/T862 2009 3 9.1冬虫 夏草 材料 选择 新鲜 、完 整。9.2表面 清洗 彻底 ，消 毒时 间充 分。9.3切除 冬虫 夏草 组织 块时 特别 注意 ，不 要触 及肠 道， 一旦 触及 肠道 ，就 放弃 分离 。重 新选 取新 的冬虫夏 草进 行分 离。 9.4切碎 的组 织块 在试 管内 分布 尽量 均匀 ，不 要挤 在一 起。
