1、ICS 65.020.30B43 DB怒 江 州 地 方 标 准DB 5333/T 12.52018兰 坪 乌 骨 绵 羊 养 殖 技 术 规 范第 5 部 分 ： 胚 胎 移 植 技 术 2018 -06- 20发 布 2018- 09-20实 施怒 江 傈 僳 族 自 治 州 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB5333/T 12.52018 I 前 言 兰 坪 乌 骨 绵 羊 养 殖 技 术 规 范 分 为 以 下 6个 部 分 ： 第 1部 分 ： 品 种 ； 第 2部 分 ： 区 域 布 局 ； 第 3部 分 ： 饲 养 管 理 ； 第 4部 分 ： 饲 草 加 工 调 制 技
2、术 ； 第 5部 分 ： 胚 胎 移 植 技 术 ； 第 6部 分 ： 产 品 质 量 。本 部 分 为 DB5333/T12的 第 5部 分 。本 标 准 按 照 GB/T 1.1 2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 由 云 南 省 兰 坪 县 兰 坪 乌 骨 绵 羊 养 殖 农 业 标 准 化 示 范 区 项 目 领 导 小 组 提 出 。本 标 准 由 怒 江 州 质 量 技 术 监 督 局 归 口 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 洪 琼 花 、 李 俊 东 、 李 东 江 、 权 国
3、波 、 张 兴 仁 、 和 四 池 、 李 庆 亮 、 张 韩 。 DB5333/T 12.52018 1 兰 坪 乌 骨 绵 羊 养 殖 技 术 规 范第 5 部 分 ： 胚 胎 移 植 技 术1 范 围本 标 准 规 定 了 兰 坪 乌 骨 绵 羊 术 语 和 定 义 、 胚 胎 移 植 的 基 本 原 则 、 供 体 羊 、 供 体 羊 的 超 排 与 配 种 、 胚胎 回 收 、 胚 胎 质 量 鉴 定 、 供 受 体 羊 的 同 期 发 情 处 理 、 胚 胎 移 植 、 妊 娠 受 体 羊 的 饲 养 管 理 。本 规 范 适 用 于 兰 坪 乌 骨 绵 羊 的 超 数 排 卵 及
4、 胚 胎 移 植 的 各 个 环 节 。2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。NY/T 826 绵 羊 胚 胎 移 植 技 术 规 程3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。3.1 供 体 羊提 供 卵 子 或 胚 胎 的 优 秀 繁 殖 母 羊 。3.2
5、受 体 羊接 受 胚 胎 （ 移 植 ） 的 母 羊 。 3.3 同 期 发 情使 用 外 源 激 素 来 调 控 一 群 母 羊 的 发 情 时 间 ， 使 之 在 预 定 的 时 间 内 集 中 发 情 并 排 卵 。3.4 超 数 排 卵 （ 简 称 超 排 ）在 母 羊 发 情 周 期 的 适 当 时 间 ， 使 用 外 源 激 素 诱 导 更 多 的 卵 泡 正 常 发 育 ， 并 多 排 卵 。3.5 胚 胎 移 植将 受 精 卵 （ 胚 胎 ） 移 植 到 受 体 子 宫 角 内 。4 胚 胎 移 植 的 基 本 原 则4.1 胚 胎 供 体 与 受 体 在 分 类 学 上 属
6、于 同 一 物 种 。 4.2 胚 胎 发 育 阶 段 与 受 体 母 羊 发 情 时 间 上 的 一 致 性 ,即 供 、 受 体 母 羊 发 情 时 间 相 差 不 超 过 24小 时 。 DB5333/T 12.52018 2 4.3 胚 胎 发 育 阶 段 与 受 体 生 殖 道 解 剖 位 置 的 一 致 性 ,即 从 供 体 母 羊 输 卵 管 收 集 到 的 胚 胎 应 移 植 到 受 体供 体 羊 的 选 择 与 饲 养 管 理5 供 体 羊5.1 供 体 羊 的 选 择5.1.1 供 体 羊 应 符 合 兰 坪 乌 骨 绵 羊 的 典 型 特 征 ， 谱 系 清 楚 ， 遗
7、传 性 稳 定 ， 种 用 价 值 高 。5.1.2 体 质 健 壮 ， 膘 情 中 等 。5.1.3 繁 殖 机 能 正 常 、 无 遗 传 和 传 染 性 疾 病 。5.1.4 年 龄 在 2 岁 6岁 。5.2 供 体 羊 的 饲 养 管 理 5.2.1 单 独 组 群 ， 专 人 管 理 。5.2.2 保 持 饲 养 环 境 稳 定 ， 避 免 应 激 反 应 ， 期 间 不 得 任 意 变 换 草 料 和 管 理 程 序 。5.2.3 加 强 饲 养 ， 在 优 质 牧 草 地 放 牧 ， 补 充 高 蛋 白 、 维 生 素 和 矿 物 质 ， 并 供 给 盐 和 清 洁 的 饮 水
8、 ， 保 证正 常 的 营 养 平 衡 。5.2.4 参 照 NY/T 826-2004 绵 羊 胚 胎 移 植 技 术 规 程 ， 详 细 记 录 羊 只 的 饲 喂 方 式 、 饲 料 配 方 ， 以 及 疾 病诊 治 、 驱 虫 羊 只 的 年 龄 、 胎 次 、 体 重 、 上 次 发 情 时 间 、 上 次 产 羔 时 间 、 断 奶 时 间 、 上 次 冲 胚 时 间 等 情 况 。5.2.5 注 射 维 生 素 A、 D、 E 合 剂 ， 促 发 情 、 提 高 妊 娠 免 疫 。6 供 体 羊 的 超 排 与 配 种6.1 超 排 处 理6.1.1 超 排 激 素 FSH（ 促
9、 卵 泡 素 ） 、 PGF2a、 CIDR（ 孕 酮 阴 道 栓 ） 、 PMSG（ 孕 马 血 清 ） 。6.1.2 超 排 方 法6.1.2.1 FSH+PG法在 自 然 发 情 周 期 的 任 意 一 天 给 母 羊 埋 置 孕 酮 阴 道 栓 ， 第 11天 开 始 采 用 递 减 法 每 天 早 晚 各 注 射 一 次FSH， 连 续 注 射 4天 ， 在 第 5次 注 射 FSH时 ， 同 时 肌 注 PGF2 。6.1.2.2 FSH+PMSG法在 自 然 发 情 周 期 的 任 意 一 天 给 母 羊 埋 置 孕 酮 阴 道 栓 ， 第 11天 开 始 采 用 递 减 法 每
10、 天 早 晚 各 注 射 一 次FSH， 连 续 注 射 4天 ， 在 第 1次 注 射 FSH时 ， 同 时 注 射 PMSG 300IU。6.2 发 情 鉴 定 在 注 射 第 七 针 FSH的 同 时 撤 除 孕 酮 阴 道 栓 ， FSH注 射 完 毕 ， 随 即 每 天 早 晚 用 试 情 公 羊 （ 带 试 情 布 或 结扎 输 精 管 ） 对 超 排 供 体 羊 进 行 试 情 ， 以 母 羊 站 立 接 受 试 情 公 羊 爬 跨 作 为 发 情 的 标 准 。6.3 配 种供 体 母 羊 发 情 后 ， 每 日 上 、 下 午 各 配 种 一 次 ， 直 至 发 情 结 束
11、。 DB5333/T 12.52018 3 7 胚 胎 回 收7.1 采 卵 （ 胚 胎 ） 时 间以 供 体 母 羊 发 情 日 为 0天 ， 在 5.5 7天 或 2 3天 用 手 术 法 分 别 从 子 宫 和 输 卵 管 回 收 胚 胎 或 受 精 卵 。7.2 采 卵 （ 胚 胎 ） 前 的 准 备7.2.1 手 术 室 设 置 及 要 求在 手 术 室 内 设 专 门 套 间 ， 作 为 胚 胎 操 作 室 。 手 术 室 要 求 洁 净 明 亮 ， 光 线 充 足 、 无 尘 、 地 面 用 水 泥 或砖 铺 成 ， 配 备 照 明 用 电 。 室 内 温 度 应 保 持 在 2
12、0 25 。 手 术 室 定 期 用 3 5%煤 酚 皂 溶 液 喷 洒 消 毒 ， 手 术前 用 紫 外 灯 照 射 1 2小 时 ， 手 术 过 程 中 不 能 随 意 开 启 门 窗 。7.2.2 回 收 胚 胎 所 需 主 要 器 械 羊 胚 胎 移 植 主 要 器 械 与 设 备 见 附 录 C。7.2.3 回 收 胚 胎 所 需 药 品新 洁 尔 灭 、 静 松 灵 、 0.9%生 理 盐 水 、 酒 精 、 碘 酒 、 青 霉 素 、 链 霉 素 等 。7.2.4 冲 胚 液 的 配 制基 液 ： 杜 氏 磷 酸 缓 冲 液 （ PBS） ， 配 方 见 附 录 A。 也 可 用
13、 进 口 PBS粉 配 制 。 冲 胚 液 ： 含 1%FCS（ 胎 犊 牛血 清 ） 或 CS（ 犊 牛 血 清 ） 的 PBS液 。7.3 采 卵 （ 胚 胎 ） 步 骤7.3.1 供 体 羊 准 备7.3.1.1 停 食 供 体 羊 手 术 前 应 停 食 24 48小 时 ， 可 供 给 适 量 饮 水 。7.3.1.2 供 体 羊 的 保 定 和 麻 醉供 体 羊 仰 放 在 手 术 保 定 架 上 ， 四 肢 固 定 。 按 每 公 斤 体 重 0.03 0.05ml 2%静 松 灵 肌 注 麻 醉 。7.3.1.3 手 术 部 位 及 消 毒手 术 部 位 一 般 选 择 乳 房
14、 前 肢 中 线 部 （ 在 两 条 乳 静 脉 之 间 ） 或 腹 中 浅 的 两 侧 均 可 。 用 电 剪 或 毛 剪 剪 去术 部 毛 ， 刮 净 毛 茬 ， 分 别 用 清 水 和 消 毒 液 清 洗 局 部 ， 然 后 由 里 向 外 涂 以 2% 4%的 碘 酒 ， 待 干 后 再 用 75%的 酒 精 棉 脱 碘 。 盖 上 创 巾 ， 使 预 定 的 切 口 暴 露 在 创 巾 开 口 的 中 部 。7.3.2 术 者 的 准 备术 者 应 将 指 甲 剪 短 ， 并 锉 光 滑 ， 穿 清 洁 手 术 服 、 戴 工 作 帽 和 口 罩 。 术 者 将 手 指 尖 到 肘
15、部 先 后 在 温 水 、0.1%的 新 洁 尔 灭 液 中 浸 洗 5分 钟 ， 双 手 消 毒 后 ， 要 保 持 供 手 姿 势 ， 避 免 与 未 消 毒 过 的 物 品 接 触 ， 一 旦 接 触 ， 即 应 重 新 消 毒 。7.3.3 手 术 法 回 收 卵 （ 胚 胎 ）7.3.3.1 组 织 分 离 DB5333/T 12.52018 4 避 开 较 大 血 管 和 神 经 、 切 口 边 缘 与 切 面 整 齐 、 切 口 方 向 与 组 织 走 向 尽 量 一 致 、 依 组 织 层 次 分 层 切 开 、切 口 长 约 5厘 米 。7.3.3.2 切 开 皮 肤用 右
16、手 的 食 指 和 拇 指 在 预 定 切 口 的 两 侧 将 皮 肤 撑 紧 固 定 ， 右 手 用 餐 刀 式 执 刀 ， 由 预 定 切 口 起 点 至 终点 一 次 切 开 ， 使 切 口 深 度 一 致 ， 边 缘 平 直 。7.3.3.3 切 开 皮 下 组 织皮 下 组 织 用 执 笔 式 执 刀 法 切 开 ， 切 时 可 先 切 一 小 口 ， 再 用 外 科 剪 刀 剪 开 。7.3.3.4 切 开 肌 肉7.3.3.5 用 钝 性 分 离 法 。 按 肌 肉 纤 维 方 向 用 刀 柄 刺 开 一 小 切 口 ， 然 后 将 刀 柄 末 端 或 用 手 指 伸 入 切 口
17、 ，沿 纤 维 方 向 整 齐 分 离 开 ， 避 免 损 伤 肌 肉 的 血 管 和 神 经 。 7.3.3.6 切 开 腹 膜先 用 镊 子 提 起 腹 膜 ， 在 提 起 部 位 作 一 切 口 ， 然 后 用 另 一 只 手 的 手 指 深 入 腹 膜 ， 用 外 科 剪 将 腹 膜 剪 开 。术 者 将 食 指 及 中 指 由 切 口 伸 入 腹 腔 ， 在 骨 盆 腔 、 膀 胱 周 围 触 摸 子 宫 角 ， 并 将 卵 巢 、 子 宫 引 出 切 口 外 ， 记录 两 侧 卵 巢 黄 体 和 滤 泡 数 。7.3.3.7 止 血毛 细 血 管 出 血 用 沙 布 轻 压 出 血
18、 处 即 可 ， 小 血 管 用 止 血 钳 止 血 ， 较 大 血 管 除 用 止 血 钳 夹 住 暂 时 止 血 外 ，必 要 时 还 需 用 缝 合 线 结 扎 止 血 。7.3.3.8 采 卵 （ 胚 胎 ） 方 法7.3.3.8.1 输 卵 管 法供 体 羊 发 情 后 2 3天 从 输 卵 管 采 集 2 8细 胞 胚 胎 ， 进 行 鲜 胚 移 植 。 方 法 ： 将 冲 卵 管 一 端 由 输 卵 管 伞 部 的 喇 叭 口 插 入 ， 约 2 3厘 米 深 ， 另 一 端 接 集 卵 皿 ， 用 注 射 器 吸 取 37 的 冲 卵 液 5 10ml， 在 子 宫 角 靠近
19、输 卵 管 的 部 位 ， 将 针 头 朝 输 卵 管 方 向 扎 入 ， 一 人 操 作 ， 一 只 手 的 手 指 在 针 头 后 方 捏 紧 子 宫 角 ， 另 一 只手 推 注 射 器 ， 冲 卵 液 即 由 宫 管 结 合 部 流 入 输 卵 管 ， 经 输 卵 管 流 至 集 卵 皿 。 此 法 优 点 是 卵 的 回 收 率 高 ， 冲卵 液 用 量 小 ， 检 卵 省 时 间 。 缺 点 是 容 易 造 成 输 卵 管 ， 特 别 是 伞 部 的 粘 连 。7.3.3.8.2 子 宫 法在 超 排 母 羊 发 情 后 5.5 7天 从 子 宫 采 集 桑 椹 胚 至 扩 张 囊
20、 胚 ， 胚 胎 可 用 于 鲜 胚 移 植 、 冷 冻 、 分 割 及 其它 研 究 。 方 法 ： 用 带 胶 管 的 肠 钳 夹 在 一 侧 子 宫 角 基 部 ， 冲 卵 针 头 （ 钝 形 ） 从 子 宫 角 尖 端 插 入 ， 当 确 认 针头 在 管 腔 内 ， 进 退 通 畅 时 ， 把 冲 卵 液 缓 慢 注 入 子 宫 腔 ， 待 子 宫 角 适 度 膨 胀 后 ， 用 子 宫 导 卵 管 从 子 宫 角 基部 导 入 子 宫 腔 ， 导 卵 管 另 一 端 接 平 皿 ， 同 时 轻 轻 挤 压 子 宫 角 前 端 ， 将 冲 卵 液 导 出 ， 每 侧 子 宫 角 需
21、要 约 30ml冲 卵 液 。 另 一 侧 子 宫 角 用 同 样 方 法 冲 洗 。 子 宫 法 对 输 卵 管 损 伤 较 小 ， 尤 其 不 涉 及 伞 部 ， 但 卵 回 收 率 较 输卵 管 法 低 ， 用 液 较 多 ， 检 卵 较 费 时 。 7.3.3.9 缝 合7.3.3.9.1 要 求 DB5333/T 12.52018 5 缝 合 前 创 口 必 须 彻 底 止 血 ， 用 加 肝 素 的 灭 菌 生 理 盐 水 冲 洗 ， 清 除 手 术 过 程 中 形 成 的 凝 块 等 ； 按 组 织层 次 分 层 缝 合 ， 对 合 严 密 、 创 缘 不 内 卷 和 外 翻 ，
22、 缝 合 进 针 和 出 针 要 距 创 缘 0.5厘 米 左 右 ， 针 间 距 要 均 匀 ，所 有 结 要 打 在 同 一 侧 。7.3.3.9.2 方 法采 用 三 层 缝 合 法 ， 即 腹 膜 、 肌 肉 连 续 缝 合 ； 皮 肤 结 节 缝 合 ， 针 角 间 距 1厘 米 。 在 肌 肉 与 皮 肤 之 间 撒适 量 青 、 链 霉 素 粉 ， 以 防 创 口 感 染 。7.3.3.10 术 后 处 理采 卵 完 毕 后 ， 用 37 灭 菌 生 理 盐 水 +肝 素 湿 润 母 羊 子 宫 ， 冲 去 凝 血 块 ， 再 涂 少 许 灭 菌 液 体 石 蜡 ， 以防 粘 连
23、 ， 将 器 官 复 位 。8 胚 胎 质 量 鉴 定 8.1 检 卵 （ 胚 胎 ） 操 作 要 求检 卵 者 应 熟 悉 体 视 镜 的 结 构 ， 做 到 熟 练 使 用 。 找 卵 的 顺 序 应 由 低 倍 到 高 倍 ， 一 般 在 10倍 左 右 即 能 发现 卵 子 ， 对 胚 胎 鉴 定 分 级 时 再 转 向 高 倍 。8.2 找 卵 （ 胚 胎 ） 要 点根 据 卵 子 的 比 重 、 大 小 、 形 态 和 透 明 带 折 光 性 等 特 点 找 卵 。 卵 子 的 比 重 比 冲 卵 液 大 ， 一 般 位 于 集 卵皿 的 底 部 ； 山 羊 卵 直 径 为 150
24、 200 m， 是 一 球 形 体 ， 在 光 镜 下 呈 圆 形 ， 其 外 层 是 透 明 带 ， 镜 检 找 到 的卵 （ 胚 ） 数 应 和 卵 巢 上 排 卵 点 的 数 量 大 致 相 当 。8.3 检 卵 （ 胚 胎 ） 方 法将 检 出 的 胚 胎 吸 入 盛 有 保 存 液 的 35mm培 养 皿 中 ， 在 培 养 皿 中 的 不 同 位 置 冲 洗 胚 胎 3 5次 ， 然 后 把全 部 卵 移 至 另 一 个 培 养 皿 ； 每 换 一 个 培 养 皿 时 应 换 新 的 玻 璃 吸 管 ， 一 个 供 体 的 卵 （ 胚 ） 放 在 同 一 个 皿 内 。 8.4 胚
25、 胎 的 质 量 鉴 定 形 态 学 方 法8.4.1 胚 胎 的 发 育 阶 段 ， 见 早 期 胚 胎 的 发 育 形 态 模 式 图 附 录 E。8.4.2 发 情 授 精 后 2 3 天 从 输 卵 管 回 收 的 卵 ， 发 育 阶 段 为 2 8 细 胞 期 ， 可 清 楚 地 观 察 到 卵 裂 球 ， 卵黄 腔 内 空 隙 较 大 。8.4.3 桑 椹 胚 发 情 后 第 5 6 天 回 收 的 卵 ， 只 能 观 察 到 球 状 的 细 胞 团 ， 分 不 清 分 裂 球 ， 细 胞 团 占 据卵 黄 腔 的 大 部 分 。8.4.4 致 密 桑 椹 胚 发 情 后 第 6
26、7 天 回 收 的 胚 胎 ， 细 胞 团 变 小 占 卵 黄 的 60-70%。8.4.5 旱 期 囊 胚 发 情 后 第 7 8天 回 收 的 胚 胎 ， 细 胞 团 的 一 部 分 出 现 发 亮 的 胚 泡 团 和 滋 养 层 。8.4.6 囊 胚 发 情 后 第 7 8天 回 收 的 胚 胎 ， 内 细 胞 团 和 滋 养 层 界 线 清 晰 ， 胚 泡 腔 明 显 ， 细 胞 充 满 卵黄 腔 。8.4.7 扩 张 囊 胚 发 情 后 第 8 9天 回 收 的 胚 胎 ， 囊 腔 明 显 扩 大 ， 体 积 增 大 到 原 来 的 1.2 1.5倍 ,与 透 明 带 之 间 无 空
27、 隙 ,透 明 带 变 薄 ， 相 当 于 正 常 厚 度 的 1/3。 8.4.8 孵 化 胚 一 般 在 发 情 后 第 9 11天 ， 由 于 胚 泡 腔 继 续 扩 张 ， 致 使 透 明 带 破 裂 ， 胚 细 胞 脱 出 。凡 在 发 情 后 第 6 8 天 回 收 的 16细 胞 以 下 的 受 精 卵 均 列 为 非 正 常 发 育 卵 ， 不 能 用 于 移 植 或 冷 冻 保 存 。8.4.9 胚 胎 的 质 量 鉴 定 DB5333/T 12.52018 6 用 形 态 学 方 法 进 行 胚 胎 质 量 鉴 定 ， 分 为 1、 2、 3、 4四 级 。 1级 ： 优
28、秀 胚 。 发 育 正 常 ， 胚 龄 与 发 育 期 相 吻 合 ， 卵 裂 球 轮 廓 清 楚 ， 透 明 度 适 中 ， 细 胞 密 度 大 ，卵 裂 均 匀 ， 无 变 性 的 细 胞 。 2级 ： 良 好 胚 。 发 育 基 本 符 合 预 定 胚 龄 ， 轮 廓 清 楚 ， 明 暗 适 中 或 稍 暗 稍 淡 ， 细 胞 密 度 较 小 或 小型 卵 裂 球 过 多 ， 细 胞 变 性 率 为 10 20%。 3级 ： 一 般 胚 ， 轮 廓 不 清 楚 ， 色 泽 过 暗 或 过 淡 ， 细 胞 密 度 小 ， 细 胞 变 性 率 为 30 40%。 4级 ： 不 可 用 胚 。
29、 未 受 精 卵 和 变 性 胚 。8.5 受 体 羊 的 选 择 及 饲 养 管 理8.5.1 发 情 周 期 正 常 ， 无 繁 殖 机 能 疾 病 的 经 产 羊 。8.5.2 健 康 、 膘 情 在 七 成 以 上 。8.5.3 年 龄 在 2 6 岁 之 间 。8.5.4 受 体 羊 单 独 组 群 加 强 饲 养 ， 保 持 环 境 相 对 稳 定 ， 避 免 应 激 反 应 。 9 供 体 羊 的 同 期 发 情 处 理9.1 自 然 发 情对 受 体 羊 群 自 然 发 情 进 行 观 察 ， 与 供 体 羊 发 情 前 后 相 差 一 天 的 羊 ， 可 作 为 受 体 。9
30、.2 诱 导 发 情用 孕 酮 阴 道 栓 控 制 同 期 发 情 ， 即 在 发 情 周 期 的 任 意 一 天 将 孕 酮 栓 塞 入 阴 道 深 处 ， 至 13 14天 取 出 ，在 取 孕 酮 栓 的 前 一 天 或 当 天 ， 肌 肉 注 射 氯 前 列 烯 醇 1支 。 24小 时 前 后 受 体 羊 可 表 现 发 情 。9.3 发 情 观 察供 、 受 体 羊 均 采 用 试 情 公 羊 确 认 发 情 ， 早 晚 各 观 察 一 次 ， 以 发 情 之 日 定 为 0天 ， 比 供 体 羊 提 前 12小时 发 情 的 定 为 +12小 时 受 体 ， 比 供 体 羊 推
31、迟 12小 时 发 情 的 受 体 定 为 -12小 时 受 体 。 鲜 胚 移 植 时 0小 时 受 体 ， 12小 时 受 体 移 植 效 果 无 显 著 差 异 ， 如 果 受 体 缺 乏 ， 可 使 用 12小 时 受 体 ， 超 过 24小 时 的 受 体 不 再 使用 。10 胚 胎 移 植10.1 移 植 季 节最 好 选 在 7 12月 份 最 为 适 宜 。10.2 受 体 羊 的 准 备受 体 羊 术 前 需 空 腹 12 24小 时 ， 仰 卧 或 侧 卧 于 手 术 保 定 架 上 ， 肌 注 0.3 0.5ml 2%静 松 灵 。 手 术 部位 及 手 术 要 求 与
32、 供 体 羊 相 同 。10.3 胚 胎 移 植 的 部 位 与 供 体 母 羊 冲 胚 部 位 一 致 ， 输 卵 管 胚 进 行 输 卵 管 移 植 ， 子 宫 胚 进 行 子 宫 移 植 。10.4 输 卵 管 移 植 DB5333/T 12.52018 7 将 有 黄 体 一 侧 的 输 卵 管 伞 部 拨 开 ， 找 到 管 口 ， 把 装 有 胚 胎 的 移 植 器 从 此 插 入 3 4厘 米 ， 然 后 将 胚 胎轻 轻 推 出 即 可 。10.5 子 宫 移 植 （ 鲜 胚 和 冻 胚 ）将 有 黄 体 一 侧 的 子 宫 角 取 出 ， 用 尖 端 磨 钝 的 16#针 头
33、 在 子 宫 壁 上 扎 一 孔 ， 把 装 有 胚 胎 的 移 植 器 从 此孔 插 入 子 宫 腔 内 ， 伸 至 子 宫 角 尖 端 后 将 胚 胎 轻 轻 推 出 即 可 。10.6 移 植 胚 胎 注 意 要 点10.6.1 胚 胎 移 至 黄 体 侧 子 宫 角 ， 无 黄 体 不 移 植 ， 一 般 移 2枚 胚 胎 。10.6.2 在 子 宫 角 打 孔 时 应 避 开 血 管 ， 防 止 出 血 。10.6.3 不 可 用 力 挖 卵 巢 ， 不 能 触 摸 黄 体 。10.6.4 胚 胎 发 育 阶 段 与 移 植 部 位 相 符 。10.6.5 对 受 体 黄 体 发 育
34、 按 突 出 卵 巢 的 直 径 分 为 优 、 中 、 差 ， 优 ： 0.6 1.0cm， 中 ： 0.5cm， 差 ： 小 于 0.5cm。11 妊 娠 受 体 羊 的 饲 养 管 理11.1 受 体 羊 要 加 强 饲 养 管 理 ， 避 免 应 激 反 应 。11.2 受 体 羊 术 后 1 2 个 情 期 内 注 意 观 察 返 情 情 况 ， 若 返 情 则 进 行 配 种 或 移 植 。11.3 妊 娠 受 体 羊 在 产 前 2个 月 要 补 充 足 量 的 维 生 素 、 微 量 元 素 ， 适 当 限 制 能 量 摄 入 ， 既 要 保 证 胎 儿 的正 常 发 育 ，
35、又 要 避 免 难 产 。11.4 产 羔 期 护 理 。 受 体 羊 产 羔 期 需 精 心 管 理 ， 做 好 助 产 ， 双 羔 合 并 哺 乳 及 保 姆 羊 带 乳 ， 并 要 保 证 哺 乳期 营 养 需 要 。 产 羔 记 录 应 详 细 、 认 真 。 DB5333/T 12.52018 8 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）冲 卵 液 的 配 制A.1 杜 氏 磷 酸 缓 冲 液 （ PBS） 配 方表 A.1 杜 氏 磷 酸 缓 冲 液 （ PBS） 配 方试 剂 材 料 浓 度 用 量氯 化 钠 Nacl 136.87mM 8.00g/L氯 化 钾 Kcl 2.68
36、mM 0.20g/L 氯 化 钙 Cacl2 (Cacl22H2O) 0.90mM 0.10g/L(0.132g/L)磷 酸 氢 钾 KH2PO4 1.47mM 0.20g/L磷 酸 氢 钠Na2HPO4(Na2HPO412H2O) 8.09mM 1.15g/L(2.916g/L)氯 化 镁 Mgcl2(Mgcl2.6H2O) 0.49mM 0.10g/L(0.2133g/L)丙 酮 酸 钠 0.33mM 0.03g/L葡 萄 糖 (葡 萄 糖 .H2O) 5.56mM 1.00g/L(1.10g/L)青 霉 素 100 单 位 /ml链 霉 素 100 单 位 /mlA.2 PBS液 的 配
37、 制配 制 PBS所 用 水 是 电 阻 值 超 过 18兆 欧 的 超 纯 水 。 为 了 便 于 保 存 ， 可 用 超 纯 水 分 别 配 制 成 A液 和 B液 ， 以 便 高 压 灭 菌 ， 也 可 配 制 成 浓 缩 10倍 的 原 液 。 配 好 的 A、 B原 液 和 超 纯 水 分 别 高 压 、 灭 菌 ， 低 温 保 存 待 用 。冲 卵 液 PH值 应 为 7.2 7.6， 渗 透 压 为 270 290osm。 PBS中 加 0.4%的 牛 血 清 白 蛋 白 可 用 于 胚 胎 的 体 外 操 作和 保 存 ， 也 可 直 接 做 为 冲 卵 液 用 于 羊 的 手
38、 术 冲 胚 和 移 植 。表 A.2 不 同 容 积 PBS液 配 制 试 剂 用 量 表原 液 试 剂 不 同 容 积 试 剂 用 量100ml 500ml 1000mlA 液 氯 化 钠 Nacl 8.00g 40.00g 80.00g氯 化 钾 Kcl 0.20g 1.00g 2.00g氯 化 钙 Cacl2 0.10g 0.50g 1.00gMgcl2(Mgcl2.6H2O) 0.10g 0.50g 1.00g B 液 Na2HPO4（ Na2HPO4.7H2O） 1.144g（ 2.16g） 5.72g（ 10.8g） 11.44g（ 21.6g）KH2PO4 0.20g 1.00
39、g 2.00g DB5333/T 12.52018 9 BB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）实 验 的 准 备B.1 器 具 的 洗 刷B.1.1 器 具 使 用 后 立 即 浸 于 水 中 ， 流 水 冲 洗 ， 然 后 再 用 洗 涤 液 清 洗 。B.1.2 新 的 玻 璃 器 皿 用 清 水 洗 净 后 ， 放 入 洗 液 或 稀 盐 酸 中 浸 泡 24小 时 ， 流 水 冲 洗 掉 洗 液 ， 再 用 洗 涤 液认 真 刷 洗 ， 或 用 超 声 波 洗 涤 器 洗 涤 。B.1.3 水 洗 ： 从 洗 涤 液 中 取 出 后 立 即 放 入 流 水 中 ， 冲 洗 3小 时
40、完 全 冲 掉 洗 涤 液 。 B.1.4 洗 净 ： 用 蒸 馏 水 洗 5次 ， 再 用 超 纯 水 冲 洗 2次 。B.1.5 干 燥 和 包 装 ： 洗 净 后 的 器 具 放 入 干 燥 箱 烘 干 ， 再 用 白 纸 或 牛 皮 纸 包 装 待 消 毒 。B.2 器 具 的 灭 菌B.2.1 高 压 灭 菌 ： 器 具 经 包 装 后 放 入 高 压 灭 菌 器 内 ， 在 121 （ 1kg/cm2） 处 理 30分 钟 ， PBS等 培 养 液 处理 15分 钟 。B.2.2 70%酒 精 浸 泡 消 毒 ： 聚 乙 烯 冲 卵 管 以 及 乳 胶 管 等 ， 洗 净 后 可
41、在 70%酒 精 液 中 浸 泡 消 毒 。B.3 培 养 液 的 灭 菌装 有 滤 膜 的 滤 器 经 高 压 灭 菌 后 使 用 ， 培 养 保 存 液 用 0.22um滤 膜 ， 过 滤 时 应 弃 去 开 始 的 2-3滴 。 C DB5333/T 12.52018 10 附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）羊 胚 胎 移 植 主 要 器 械 与 设 备C.1 回 收 胚 器 械C.1.1 冲 卵 管 带 硅 胶 管 的 7号 针 头 （ 钝 形 ） 。C.1.2 回 收 管 带 硅 胶 管 的 16号 针 头 （ 钝 形 ） 。C.1.3 肠 钳 （ 套 乳 胶 管 ） 。C.1.4
42、 注 射 器 ： 20ml、 10ml、 5ml、 3ml、 2ml、 1ml。C.1.5 集 卵 杯 ： 50ml或 100ml烧 杯 。C.2 检 胚 设 备 C.2.1 体 视 显 微 镜 。C.2.2 35mm培 养 皿 。C.2.3 表 面 皿 。C.2.4 巴 氏 玻 璃 管 。C.2.5 培 养 箱 。C.3 移 植C.3.1 12号 针 头 。C.3.2 移 植 器 ： 用 卡 介 苗 注 射 器 控 制 成 长 5 6cm， 直 径 1 1.2mm的 细 管 ， 冷 却 后 用 砂 片 将 尖 端 断 齐 ，再 将 芯 插 入 管 内 ， 将 断 齐 的 口 端 在 酒 精
43、灯 上 烘 圆 滑 ， 即 制 成 移 植 器 。C.4 手 术 器 械 C.4.1 毛 剪 、 外 科 剪 （ 尖 头 ） 。C.4.2 活 动 刀 柄 、 刀 片 。C.4.3 止 血 钳 （ 弯 头 、 直 头 ） 。C.4.4 创 巾 夹 。C.4.5 持 针 器 。C.4.6 手 术 镊 （ 带 齿 ） 。C.4.7 缝 合 针 （ 园 刃 针 、 三 棱 针 ） 。C.4.8 缝 合 线 （ 丝 线 、 肠 线 ） 。C.4.9 创 巾 。C.4.10 手 术 保 定 架 。C.4.11 活 动 手 术 器 械 车 。C.5 其 他 C.5.1 蒸 馏 水 装 置 一 套 。 DB
44、5333/T 12.52018 11 C.5.2 超 纯 水 仪 一 台 。C.5.3 干 燥 箱 一 台 。C.5.4 高 压 消 毒 锅 一 台 。C.5.5 滤 器 、 滤 膜 。C.5.6 PH计 一 台 。C.5.7 渗 透 压 仪 一 台 。C.6 药 品 及 试 剂C.6.1 配 制 PBS所 需 试 剂 。C.6.2 FSH、 LH、 PGF2 、 PMsG。C.6.3 2%静 松 灵 。C.6.4 肾 上 腺 纱 及 止 血 药 品 。 C.6.5 抗 生 素 及 其 它 消 毒 液 、 纱 布 、 药 棉 等 。 D DB5333/T 12.52018 12 附 录 D（
45、规 范 性 附 录 ）胚 胎 移 植 记 录 表D.1 供 体 羊 超 数 排 卵 记 录 表 表 D.1 供 体 羊 超 数 排 卵 记 录 表供 体 号 品 种 出 生 时 间 （ 年 龄 ）产 羔 时 间 胎 次处 理 前 发 情 日 期 （ 1） 年 月 日 （ 2） 年 月 日超 排 处 理 日 期 年 月 日 激 素 批 号总 剂 量 每 日 剂 量 （ 1） （ 2） （ 3） （ 4） 促 排 药 注 射 日 期 剂量 发 情 时 间 年 月 日 症状输 精 时 间 （ 1） （ 2） （ 3） 公 羊 号回 收 卵 时间 年 月 日 开 始 时 间 时 分 结 束 时 分冲
46、卵 人 检 卵 人卵巢 冲卵液回收率 卵 巢 回收卵数 未受精卵 退化卵 2-16细胞 胚 胎 发 育 与 等 级CL F 枚数 等级 M CM EB BL EXB HB 左 ABC右 ABCD.2 受 体 羊 移 植 记 录 表 表 D.2 受 体 羊 移 植 记 录 表序 号 受 体号 供 体号 群 号 发 情日 期 返 情日 期 黄 体发 育 移 植时 间 胚 胎等 级 术 者 产 羔 备 注 DB5333/T 12.52018 13 D.3 冷 冻 胚 胎 记 录 表 表 D.3 冷 冻 胚 胎 记 录 表供 体号 品 种 操 作者冲 卵结 束时 间 冷 冻时 间 防 冻剂 冷 冻方
47、法序 号 发 育阶 段 级 别 简 图 特 征简 述 提 篓号 简 号 解 冻温 度 脱 甘油 方式 解 冻后 形态 培 养情 况 用 途 备 注 DB5333/T 12.52018 14 附 录 E（ 资 料 性 附 录 ）早 期 胚 胎 的 发 育 形 态 模 式 图E.1 早 期 胚 胎 的 发 育 形 态 模 式 图1. 1-cell （ day 1） 2. 2-cell（ day 2） 2. 4-cell（ day 3）2. 8-cell（ day 4） 2. 16-cell（ day 5） 3. Early morula（ day 5-6） 4. morula（ day 6） 5. Early blastocyst（ day 7） 6. Blastocyst（ day 7-8）7.Expanded blastocyst（ day 8-9） 8.Hatched blastocyst（ day 9） 9. Expandinghatched blastocyst（ day 9-10） _
