1、ICS 11.220CCS B 41云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1059.4 2021滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 4部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantinetechniquefor Rhinopithecus bietiPart4:Technicalspecificationsforlaboratoryexaminationof Shigella spp. 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 管 局 发 布 53 DB53/T 1059.42021 I 目 次前 言 .III引 言 .
2、1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 总 则 .26 志 贺 杆 菌 分 类 .2 7 仪 器 设 备 和 试 剂 .37.1 采 样 用 品 .37.2 实 验 器 材 .37.3 试 剂 及 参 考 菌 株 .38 样 品 .48.1 采 样 要 求 .48.2 采 样 程 序 .48.3 样 品 保 存 与 运 输 .49 试 验 步 骤 .49.1 细 菌 分 离 培 养 与 生 化 试 验 .49.2 志 贺 杆 菌 DPCR分 群 检 测 .5 10 试 验 数 据 处 理 .610.1 培 养 及 染 色 特 性
3、判 读 .610.2 生 化 试 验 结 果 判 读 .610.3 核 酸 检 测 结 果 及 判 定 .7附 录 A（ 规 范 性 ） 培 养 基 及 试 剂 配 制 .8附 录 B（ 规 范 性 ） 采 样 记 录 表 .9附 录 C（ 规 范 性 ） 革 兰 染 色 程 序 .10 DB53/T 1059.42021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 的 第 3部 分 。 D
4、B53/T1059已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局
5、 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 陈 培 富 、 黄 艳 梅 、 胡 世 享 、 李 宁 、 卓 娜 、 李 杰 、 何 依 蓉 、 钱 丽 敏 、 杨 建 发 、邹 丰 才 。 DB53/T 1059.42021 引 言滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 是 中 国 特 有 珍 稀 濒 危 灵 长 类 动 物 ， 属 于 国 家 级 重 点
6、保 护 野 生 动 物 ，列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 （ IUCN） 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 编 制 并 发 布 DB53/T1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 推 进 滇 金 丝 猴 疫 病 诊 断 的 标 准 化 和 规 范 化 ， 指 导 从 事 野 生 动 物 保 护 相 关 的 专 业 人 员 按 规 范 程序 实 施 对 滇 金 丝 猴 相 关 病 原 的 实 验 室 检 测 ， 为 滇 金 丝 猴 的 科 学 研 究 和 保 护 工 作 提 供 病 原 或 疫 病 调 查 的 基础 数 据 ， 为 滇 金 丝 猴 检 疫 、 疫
7、病 监 测 和 防 治 提 供 重 要 的 参 考 依 据 ， 促 进 滇 金 丝 猴 繁 育 和 扩 群 ， 维 护 地 区物 种 与 生 态 平 衡 ， 提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2部 分 ： 毛 首 线
8、虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试 验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 3部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第
9、 4部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则 、 志贺 杆 菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 。 DB53/T 1059.42021 1 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 4 部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 ： 本 文 件 涉 及 人 兽 共 患 病 原 体 的 操 作 ， 应 在 符 合 国 家 相 关 生 物 安 全 规 定 （ GB 19
10、489和NY/T 541） 的 条 件 下 进 行 。 涉 及 活 体 动 物 的 操 作 应 考 虑 动 物 福 利 。1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 检 疫 技 术 中 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 志 贺 杆菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 中 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规
11、范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求NY/T541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 志 贺 杆 菌 Shigella spp. 肠 杆 菌 科 中 的
12、 一 个 属 ， 是 灵 长 类 细 菌 性 痢 疾 的 病 原 。3.2 带 菌 者 carriers无 临 床 表 现 ， 从 粪 便 中 分 离 到 志 贺 杆 菌 的 个 体 。3.3 保 定 physicalrestraint采 用 化 学 或 物 理 方 式 ， 让 动 物 固 定 保 持 某 种 姿 势 或 某 个 体 位 ， 以 便 于 救 护 人 员 进 行 检 查 、 采 样 或 治疗 。 可 用 麻 醉 药 物 或 镇 静 剂 保 定 ， 也 用 特 制 笼 具 、 平 台 、 布 袋 、 绳 索 以 及 其 它 方 式 保 定 。3.4 平 板 划 线 platestr
13、eaking用 灭 菌 接 种 环 蘸 取 含 菌 样 品 ， 在 琼 脂 平 板 表 面 上 作 多 次 由 点 到 线 的 划 线 稀 释 而 获 得 较 多 独 立 分 布 的单 个 微 生 物 细 胞 ， 并 让 其 成 长 为 单 菌 落 的 纯 培 养 方 法 。3.5 凝 集 试 验 agglutinationtest DB53/T 1059.4 2021 2 颗 粒 性 抗 原 （ 如 细 胞 ） 与 特 异 性 抗 体 结 合 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 沙 粒 样 免 疫 复 合 物 的 一 类 血 清 学 反 应 ，用 于 定 性 及 定 量 检 测 抗 原 或 抗
14、体 。3.6 分 型 血 清 typingsera单 价 分 型 血 清 仅 含 有 针 对 某 特 定 类 型 的 抗 原 （ 如 细 菌 O抗 原 ） 的 特 异 性 抗 体 ， 多 价 分 型 血 清 包 含 针对 至 少 3个 特 定 类 型 的 抗 原 （ 如 细 菌 O抗 原 ） 的 特 异 性 抗 体 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。BLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basiclocalalignmentsearchtoolbp： 碱 基 对 BasepairddH 2O： 双 蒸 水 Doubledistil
15、ledwaterdNTP： 脱 氧 核 苷 酸 DeoxyribonucleotidetriphosphateDPCR： 双 重 PCRDualpolymerasechainreactionipaH： 侵 袭 性 质 粒 抗 原 HInvasiveplasmidantigenHMAC： 麦 康 凯 MacConkeyPCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 PolymerasechainreactionprpB： 磷 蛋 白 质 磷 酸 酶 BPhosphoproteinphosphataseBTAE： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 酸 -乙 二 胺 四 乙 酸 钠 Tris-Acetat
16、e-EDTATE： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 二 胺 四 乙 酸 钠 Tris-EDTATris： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTSI： 三 糖 铁 TripleSugarIronXLD： 木 糖 -赖 氨 酸 -脱 氧 胆 盐 Xylose-Lysine-Deoxycholate 5 总 则5.1 分 离 培 养 ： 采 集 滇 金 丝 猴 腹 泻 粪 样 检 测 志 贺 杆 菌 ， 做 增 菌 培 养 后 ， 再 做 选 择 性 培 养 ， 以 提 高 志 贺杆 菌 检 出 率 。5.2 培 养 特 性 观 察
17、： 对 选 择 性 培 养 得 到 的 分 离 菌 株 做 革 兰 染 色 和 培 养 特 性 观 察 ， 获 得 革 兰 染 色 呈 阴 性且 在 三 糖 铁 高 层 斜 面 琼 脂 中 斜 面 产 碱 、 底 层 产 酸 、 不 产 氢 气 和 硫 化 氢 ， 在 半 固 体 琼 脂 斜 面 试 管 中 无 运 动力 的 分 离 菌 株 。5.3 细 菌 生 化 试 验 ： 对 符 合 5.2培 养 特 性 的 分 离 菌 株 做 细 菌 生 化 试 验 ， 依 据 分 离 菌 株 生 化 特 性 对 其 做出 志 贺 杆 菌 分 类 的 基 本 判 定 。5.4 分 子 鉴 定 ： 使
18、用 DPCR扩 增 分 离 菌 株 核 酸 ： 检 测 5.2或 5.3的 分 离 菌 株 ， 做 出 分 子 鉴 定 。6 志 贺 杆 菌 分 类 志 贺 杆 菌 属 分 为 4个 群 或 种 ：a) A群 即 痢 疾 志 贺 杆 菌 （ S. dysenteriae） ， 有 10个 血 清 型 ， 是 唯 一 不 能 发 酵 甘 露 醇 的 志 贺 杆 菌 ；b) B群 即 福 氏 志 贺 杆 菌 （ S. flexneri） ， 有 13个 血 清 型 ， 各 型 间 有 血 清 学 交 叉 反 应 ；c) C群 即 鲍 氏 志 贺 杆 菌 （ S. boydii） ， 有 18个 血
19、 清 型 ； DB53/T 1059.42021 3 d) D群 即 宋 内 志 贺 杆 菌 （ S. sonnei） ， 只 有 1个 血 清 型 ， 是 唯 一 表 达 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 和 -半 乳 糖 苷酶 的 志 贺 杆 菌 。7 仪 器 设 备 和 试 剂7.1 采 样 用 品7.1.1 个 人 防 护 装 备 ， 包 括 防 护 服 、 乳 胶 手 套 或 聚 乙 烯 手 套 、 +/-N95 或 FFP2 面 罩 、 护 目 镜 、 鞋 套等 。7.1.2 样 品 采 集 及 记 录 用 品 ， 包 括 装 有 保 存 介 质 的 采 样 管 或 无 菌 空 容 器 、
20、动 物 检 疫 器 械 箱 、 人 造 纤 维或 聚 酯 纤 维 棉 签 、 剪 刀 、 镊 子 、 注 射 器 （ 带 针 头 ） 、 酒 精 棉 、 碘 伏 棉 、 酒 精 灯 、 封 口 袋 、 标 签 纸 、 记 号笔 、 记 录 表 格 等 。7.1.3 样 品 暂 存 运 输 装 备 ， 包 括 保 温 箱 、 冰 盒 或 液 氮 容 器 、 吸 水 填 充 材 料 、 包 装 胶 带 、 警 示 标 识 等 。 7.1.4 样 品 保 存 装 备 ， 包 括 低 温 冰 箱 （ 4 、 20 ） 、 超 低 温 冰 箱 （ 80 ） 、 液 氮 罐 等 。7.1.5 保 定 用
21、品 ， 包 括 操 作 笼 、 防 咬 嘴 套 、 眼 罩 及 麻 醉 药 物 （ 如 氯 胺 酮 注 射 液 ） 或 镇 静 药 物 （ 如 舒 泰 ） 。7.2 实 验 器 材台 式 离 心 机 、 小 型 离 心 机 、 微 量 可 调 移 液 器 、 恒 温 水 浴 锅 、 旋 涡 混 匀 仪 、 核 酸 蛋 白 分 析 仪 、 PCR 扩增 仪 、 电 泳 槽 、 电 泳 仪 等 电 泳 装 置 、 凝 胶 成 像 仪 、 冰 箱 （ 4 和 20 ） 、 高 压 灭 菌 锅 、 鼓 风 干 燥 箱 、液 氮 罐 、 电 子 天 平 、 带 滤 芯 移 液 头 、 PCR反 应 管
22、等 。7.3 试 剂 及 参 考 菌 株志 贺 杆 菌 增 菌 肉 汤 、 XLD琼 脂 培 养 基 、 MAC琼 脂 培 养 基 、 TSI琼 脂 、 半 固 体 和 营 养 琼 脂 斜 面 、 -半乳 糖 苷 酶 、 尿 素 、 赖 氨 酸 脱 羧 酶 、 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 、 水 杨 苷 、 七 叶 苷 、 靛 基 质 、 甘 露 醇 、 棉 子 糖 、 甘 油 、葡 萄 糖 胺 、 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 、 粘 液 酸 盐 、 10%十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS） 、 蛋 白 酶 K（ 20mg/mL） 、 氯化 钠 （ 5mol/L） 、 十 六 烷 基 三 甲
23、 基 溴 化 铵 （ CTAB） /氯 化 钠 溶 液 （ 10%CTAB和 0.7mol/L氯 化 钠 ） 、 三 氯 甲 烷 、 异 戊 醇 、 70%乙 醇 、 异 丙 醇 、 TE溶 液 、 10PCR缓 冲 液 、 dNTPs、 Taq DNA聚 合 酶 、 DPCR分 群检 测 所 用 引 物 （ 见 表 1） 、 TAE电 泳 缓 冲 液 、 志 贺 杆 菌 分 型 血 清 、 志 贺 杆 菌 参 考 菌 株 （ 阳 性 对 照 菌 株 ） 、阴 性 对 照 菌 株 （ 如 沙 门 氏 菌 或 大 肠 埃 希 菌 ） 。 部 分 培 养 基 及 试 剂 配 制 方 法 见 附 录
24、 A。表 1 志 贺 杆 菌 DPCR 分 群 检 测 所 用 引 物 序 列致 病 菌 名 称 基 因 名 称 引 物 序 列 53 预 期 片 段 （ bp）志 贺 杆 菌 属 ipaH 上 游 引 物 GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC下 游 引 物 GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC 629福 氏 志 贺 杆 菌 prpB 上 游 引 物 TATCAGTTATTACAATCCCGCT下 游 引 物 ATCTATTGCCTCTTGTTGCAAT 263 宋 内 志 贺 杆 菌 prpB 上 游 引 物 AGAGCAACAAGAGGCAATAG下 游
25、 引 物 CATTACCGTGCGATGGCA 102鲍 氏 志 贺 杆 菌 hypotheticalprotein 上 游 引 物 GAGCACGGAAACAGAGAGCGCC下 游 引 物 GGTGCGTTCTTCCGGTGTTCTG 240痢 疾 志 贺 杆 菌 SHT 上 游 引 物 GCCAGTACACCTCAACGTAC下 游 引 物 ATTCCTTCGCAACCACATTAAC 173 DB53/T 1059.4 2021 4 8 样 品8.1 采 样 要 求8.1.1 采 样 人 员 应 为 兽 医 或 动 物 保 护 相 关 的 专 业 技 术 人 员 。8.1.2 开 展
26、采 样 工 作 前 ， 应 了 解 、 掌 握 采 样 区 域 内 滇 金 丝 猴 的 种 群 数 量 、 活 动 规 律 、 生 活 习 性 及 保 定方 法 ， 制 定 样 品 采 集 、 运 输 和 保 存 等 完 整 的 技 术 方 案 ， 并 办 理 样 品 采 集 和 运 输 相 关 手 续 ， 确 保 采 样 过 程的 科 学 性 、 安 全 性 以 及 样 品 的 可 溯 源 性 。 样 品 可 采 集 动 物 园 或 饲 养 基 地 圈 养 的 金 丝 猴 ， 但 应 得 到 相 应 主管 部 门 的 许 可 。8.1.3 采 样 安 全 与 防 护 。 采 样 人 员 应
27、规 范 穿 戴 全 套 个 人 卫 生 安 全 防 护 装 备 做 好 自 我 防 护 。 与 样 品 直 接接 触 的 器 具 均 应 提 前 做 灭 菌 处 理 以 防 样 品 被 污 染 。 应 准 备 垃 圾 袋 带 回 采 样 过 程 中 产 生 的 所 有 废 弃 物 品 ，避 免 污 染 环 境 和 造 成 疫 病 传 播 。8.1.4 采 样 完 成 后 ， 所 使 用 的 器 械 、 容 器 、 个 人 防 护 用 品 等 均 要 进 行 无 害 化 处 理 。 8.2 采 样 程 序8.2.1 采 集 滇 金 丝 猴 粪 便 时 需 选 取 新 鲜 （ 未 干 涸 变 色
28、变 样 ） 粪 便 ， 同 一 堆 粪 便 只 采 集 一 份 样 品 （ 可 分装 于 多 只 采 集 管 内 ） ， 且 尽 量 采 取 粪 便 内 部 未 被 氧 化 部 分 ， 不 成 形 粪 便 应 避 免 采 取 粪 便 中 的 白 色 部 分 。除 对 已 排 泄 的 粪 样 进 行 采 集 ， 还 可 采 集 病 死 猴 肛 门 棉 拭 子 。8.2.2 采 集 粪 便 时 用 棉 签 蘸 取 粪 便 放 入 对 应 采 集 管 中 ， 每 采 集 一 个 样 品 更 换 一 个 棉 签 ， 并 做 好 样 品 标记 和 采 样 记 录 。 记 录 包 括 样 品 编 号 、
29、采 集 管 数 、 种 群 、 采 集 地 名 、 采 集 日 期 、 采 集 人 、 经 度 纬 度 、 海 拔 、粪 样 新 鲜 程 度 、 生 境 状 况 等 采 样 信 息 （ 见 附 录 B） 。 在 采 集 粪 便 样 品 时 ， 应 填 写 滇 金 丝 猴 采 样 记 录 表 （ 见 附 录 B中 表 B.1） 。8.3 样 品 保 存 与 运 输新 鲜 粪 样 应 放 入 无 菌 的 螺 盖 试 管 或 封 口 塑 料 袋 中 保 存 。 采 集 或 处 理 的 样 品 在 4 条 件 下 保 存 应 不 超过 24h； 若 需 长 期 保 存 ， 应 置 于 80 冰 箱 ，
30、 不 宜 反 复 冻 融 。 样 品 应 立 即 放 入 4 保 温 箱 内 并 尽 快 送 实 验 室 检 查 。9 试 验 步 骤9.1 细 菌 分 离 培 养 与 生 化 试 验9.1.1 增 菌 培 养以 无 菌 操 作 取 检 样 25g(mL)， 加 入 装 有 灭 菌 225mL志 贺 杆 菌 增 菌 肉 汤 的 均 质 杯 ， 用 旋 转 刀 片 式 均质 器 以 8000r/min 10000r/min均 质 ： 或 加 入 装 有 225mL志 贺 杆 菌 增 菌 肉 汤 的 均 质 袋 中 ， 用 拍 击 式 均 质器 连 续 均 质 1min 2min， 液 体 样 品
31、 振 荡 混 匀 即 可 。 于 41 1 厌 氧 培 养 16h 20h。9.1.2 选 择 性 培 养取 增 菌 培 养 后 的 志 贺 杆 菌 悬 液 ， 分 别 采 取 平 板 划 线 法 接 种 于 XLD琼 脂 平 板 和 MAC 琼 脂 平 板 或 志 贺 杆 菌 显 色 培 养 基 ， 于 36 1 培 养 20h 24h， 观 察 各 个 平 板 上 生 长 的 菌 落 形 态 。 如 出 现 的 菌 落 不典 型 或 菌 落 较 小 不 易 观 察 ， 则 继 续 培 养 至 48h再 进 行 观 察 。9.1.3 培 养 特 性 观 察 及 革 兰 染 色 镜 检 DB5
32、3/T 1059.42021 5 从 选 择 性 固 体 培 养 基 （ 琼 脂 平 板 ） 上 分 别 挑 取 符 合 志 贺 杆 菌 典 型 形 态 的 单 个 菌 落 ， 分 别 接 种 于 TSI琼 脂 斜 面 、 半 固 体 琼 脂 斜 面 和 营 养 琼 脂 斜 面 各 1管 ， 置 36 培 养 20h 24h， 观 察 培 养 结 果 。 按 常 规 革兰 染 色 程 序 （ 见 附 录 C） 对 细 菌 进 行 染 色 并 镜 检 。9.1.4 生 化 试 验 及 附 加 生 化 试 验9.1.4.1 生 化 试 验取 9.1.3培 养 形 成 的 菌 落 ， 进 行 生 化
33、 试 验 ， 即 接 种 细 菌 于 生 化 鉴 定 管 ， 36 培 养 20h 24h， 观 察 细菌 生 长 情 况 。9.1.4.2 附 加 生 化 试 验为 排 除 与 志 贺 杆 菌 生 化 特 征 相 似 的 某 些 非 产 气 大 肠 埃 希 菌 （ anaerogenic E. coli） 和 碱 性 -异 型（ AlkalescenDisparbiotype,A-D） 细 菌 ， 符 合 9.1.4.1志 贺 杆 菌 属 生 化 特 性 的 培 养 物 ， 还 需 另 加 做 葡 萄 糖 胺 、 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 和 黏 液 酸 盐 试 验 （ 36 培 养 24
34、h 48h） 。9.2 志 贺 杆 菌 DPCR分 群 检 测9.2.1 细 菌 基 因 组 DNA 的 制 备9.2.1.1 取 10.1得 到 的 增 菌 液 1.5mL， 加 到 1.5mL无 菌 离 心 管 中 ， 13000g离 心 1min。9.2.1.2 吸 弃 上 清 液 ， 留 取 沉 淀 ， 加 567LTE溶 液 （ pH8.0） ， 悬 浮 ， 加 30L10%SDS和 3L蛋白 酶 K（ 20mg/mL） ， 混 匀 ， 37 温 浴 1h。9.2.1.3 加 100L氯 化 钠 （ 5mol/L） ， 混 匀 加 80LCTAB/氯 化 钠 溶 液 ， 混 匀 ，
35、65 温 浴 10min。9.2.1.4 加 等 体 积 三 氯 甲 烷 /异 戊 醇 （ 体 积 比 为 24:1） ， 混 匀 ， 13000g离 心 10min， 取 上 清 液 ， 加 等体 积 酚 /三 氯 甲 烷 /异 戊 醇 (体 积 比 为 25:24:1)， 混 匀 ， 13000g离 心 10min。9.2.1.5 取 上 清 液 ， 加 0.6倍 体 积 异 丙 醇 ， 轻 轻 混 匀 ， 13000g离 心 10min。9.2.1.6 取 沉 淀 ， 用 70%乙 醇 清 洗 2次 ， 干 燥 ， 加 100LTE溶 液 （ pH8.0） 溶 解 ， 即 为 DNA 溶
36、 液 。 9.2.1.7 若 不 立 即 检 测 ， 可 暂 时 保 存 于 -20 冰 箱 。 按 9.2.1所 述 方 法 制 备 阴 性 、 阳 性 对 照 菌 株 的 增 菌液 基 因 组 DNA。 也 可 使 用 商 业 化 的 DNA提 取 试 剂 盒 并 按 其 说 明 制 备 模 板 DNA。9.2.2 DNA浓 度 和 纯 度 的 测 定取 5LDNA溶 液 加 水 梯 度 稀 释 至 1mL， 使 用 核 酸 蛋 白 分 析 仪 或 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 260nm和 280nm处 的 光 密 度 值 。 DNA的 浓 度 按 照 以 下 公 式 计 算 ：c
37、=AN50/1000.(1)式 中 ：cDNA浓 度 ， 单 位 为 微 克 每 微 升 (g/L)；A260nm处 的 吸 光 值 ；N核 酸 稀 释 倍 数 。 注 1： 1OD260nm=50g/mL双 链 DNA。注 2： 当 OD260/OD280比 值 在 1.7 1.9之 间 时 ， DNA纯 度 良 好 ， 适 宜 于 PCR扩 增 。9.2.3 PCR扩 增9.2.3.1 PCR 扩 增 体 系 ： 10PCR缓 冲 液 2L， dNTPs（ 10mmol/L） 2L， Taq DNA 聚 合 酶 （ 5U/L）0.2L， 模 板 DNA（ 50ng/L） 2L， 志 贺 杆 菌 属 和 任 一 志 贺 杆 菌 群 （ 福 氏 志 贺 杆 菌 、 宋 内 志 贺 杆 菌 、鲍 氏 志 贺 杆 菌 或 痢 疾 志 贺 杆 菌 ） 的 上 游 与 下 游 引 物 （ 10mol/L） 各 0.5L， 补 充 双 蒸 水 至 总 体 积 25L。 DB53/T 1059.4 2021 6 9.2.3.2 PCR扩 增 程 序 ： 94 预 变 性
