1、 ICS 65.020.30 CCS B41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2503 2022 捕食线虫 性 真菌捕 食活性评 价技术规 范 Specification for predatory activity of nematode-trapping fungi 2022-01-25 发布 2022-02-25 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2503 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定 起草。 本文件 由内 蒙古 畜牧 业标 准化技
2、 术委 员会 （SAM/TC 19 ）归 口。 本文件 起草 单位 ： 内蒙 古 自治区 农牧 业科 学院 、 内 蒙古农 业大 学 、 兴 安盟 科 尔沁右 翼前 旗农 牧业 科 学技术 发展 中心 、 中华 人 民共和 国呼 和浩 特海 关 、 通辽市 科尔 沁左 翼中 旗畜 牧工作 站 、 内 蒙古 自治 区 动 物疫病 预防 控制 中心 。 本文件 主要 起草 人： 李军 燕、 罗 晓平 、 王 瑞、 杨晓 野、 凤 英、 乔蕾 、 邵 国玉 、 陈林 军、 王文 蕊、 樊 凤娇、 高娃 、耿 万恒 、陈 伟、刘 阳、 王鹏 龙。 DB15/T 2503 2022 1 捕食线虫 性真菌
3、 捕食活性 评价技 术规范 1 范围 本文件 规定 了捕 食线 虫性 真菌捕 食活 性的 评价 方法 及指标 。 本文件 适用 于捕 食线 虫性 真菌捕 食活 性的 评价 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。
4、 捕食线 虫性 真菌 nematode trapping fungi 能够产 生捕 食性 器官 ，将 线虫幼 虫捕 获致 死的 一类 杀线虫 性真 菌。 捕食性 器官 trapping fungus 由 捕 食 线虫 性 真菌 菌 丝营养 细 胞 自发 或 在一 定 条件刺 激 下 特化 产 生的 一 个或多 个 细 胞， 简 称捕 食 器。 胃肠道 线虫 gastrointestinal nematode 能够寄 生在 动物 胃肠 道内 的线虫 。 目标虫 体 target parasite 为评价 捕食 线虫 性真 菌杀 线虫活 性而 使用 的虫 体。 本文件 确定 使用 捻转 血矛 线虫
5、三 期幼 虫 （ 捻转 血 矛线虫L3）。 捕食率 trapping rate DB15/T 2503 2022 2 被捕食 线虫 性真 菌捕 获的 目标虫 体占 目标 虫体 总量 的百分 率。 4 目标虫 体及 捕食 线虫 性真 菌培养 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫培 养与收 集 取感染 有捻 转血 矛线 虫的 羊只粪 便样 本， 于28 条 件下培 养， 收集 感染 性幼 虫，实 验用 水应 符 合 GB/T 6682 的相 关规 定。 详 细步骤 见附 录A 。 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫的 无菌处 理 将 收 集 的捻 转 血矛 线 虫L3用 无 菌 蒸馏 水 、抗 生 素等反 复
6、洗 涤， 以 达到 无 菌效果 ， 实 验用 水 应符 合 GB/T 6682 的相 关规 定。 详 细步骤 见附 录A 。 有孔玉 米粉 琼脂 培养 基的 制备 取商品 化的 玉米 粉琼 脂培 养基， 经高 压后 制备 有孔 固体培 养基 ，实 验用 水应 符合GB/T 6682 的相 关 规定。 详细 步骤 见附 录B 。 捕食线 虫性 真菌 的培 养 取待检 捕食 线虫 性真 菌， 置于有 孔玉 米粉 琼脂 培养 基中进 行培 养。 详细 步骤 见附录B。 5 捕食线 虫性 真菌 捕食 活性 评价方 法 操作步 骤 在显微 镜下观 察有 孔玉米 粉琼脂 培养基 上捕 食线虫 性真菌 的生
7、长 情况 ，待其5 个孔完 全被菌 丝覆 盖 后，取 出培 养皿 ，在 生物 安全柜 中加 入按4.2 处理 且 活力正 常、30 d内 收集 的 捻转血 矛线 虫L3 ，每 孔加 入约50 条。 自加 入虫 体6 d 后，于 显微 镜下 观察 并统 计捕食 率， 捕食 率以5个 培 养孔的 平均 捕食 率计 算。 捕食率 统计 目标虫 体被 捕食 线虫 性真 菌的捕 食器 捕获 无法 挣脱 为捕食 成功 。捕 食率 计算 公式如 下： A= X/ （X+Y ） 100 %. （1 ） 式中： A 表示 捕食 率； X 表示 被捕 获的 虫体 数 ； Y 表示 自由 活动 的虫 体 数。 6
8、捕食线 虫性 真菌 捕食 活性 评价指 标 捕食线 虫活 性评 价标 准 以捕食 线虫 性真 菌捕 食率 的高低 评价 其捕 食活 性的 强弱。 捕食线 虫活 性强 DB15/T 2503 2022 3 捕食线 虫性 真菌 对目 标虫 体的捕 食率 大于70 % 。 捕食线 虫活 性中 等 捕食线 虫性 真菌 对目 标虫 体的捕 食率 大于50 % 且不 大于70 % 。 捕食线 虫活 性弱 捕食线 虫性 真菌 对目 标虫 体的捕 食率 不大 于50 % 。 DB15/T 2503 2022 4 A A 附录A （规范 性） 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫培 养、收 集与 无菌 化处 理 A.1
9、 实验动 物 感染有 捻转 血矛 线虫 的羊 只，无 其他 胃肠 道线 虫感 染。 A.2 仪器与 试剂 A.2.1 仪器设 备 生化培 养箱 （温 度范 围：0 60 ； 温 度波 动度 ： 0.5 ） 、 离心 机 （15 mL水 平转 子；4000 rpm ） 、高 压蒸 汽灭 菌锅 （ 最高温 度:135 ； 最高 压 力：0.24 MP）。 A.2.2 试剂耗 材 甲醛、 青霉 素、 链霉 素、 卡那霉 素、 制霉 菌素 、 水 溶性两 性霉 素B 、 医 用纱 布 、 镊子 （14 cm ） 、 蒸 馏水喷 壶、 烧杯 、一 次性 吸管、 移液 器、 吸头 、细 胞培养 瓶、15
10、mL离 心管 、 一次性 收粪 袋（ 材质 ：40 目-100 目尼 龙网 ）、 搪瓷 盘（16 cm 24 cm 5 cm ）。 A.2.3 耗材的 无菌 化处 理 将所需 耗材 置于 高压 蒸汽 灭菌锅 内， 经121 ，25 min 灭 菌后 室温 保存 。 A.3 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫的 培养 取感染 有捻 转血 矛线 虫的 羊只新 鲜粪 便 ， 置 于干 净 的搪瓷 盘中 ， 顶部 稍高 于 搪瓷盘 边缘 ， 其上 盖两 层医用 纱布 ，盖 好搪 瓷盘 盖，置 于28 恒温 箱中 。 每日定 时搅 拌疏 松粪 便， 并喷洒 蒸馏 水使 粪便 保 持 湿度。 A.4 捻转血 矛
11、线 虫三 期幼 虫的 收集 培养7 d 后 ，用 灭菌 蒸馏 水 将盖上 的捻 转血 矛线 虫L3 冲洗到 无菌 烧杯 中， 自然 沉淀后 弃去 上清 ， 用 无菌蒸 馏水 调整 浓度 为1000 条/ml ， 置于 细胞 培养 瓶 中，液 面高 度约0.5 cm，10 保 存备 用。 A.5 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫的 无菌化 处理 将收集 的捻转 血矛 线虫L3 用无菌 水4000 r/min离心5 min ，重复 洗涤3 次。 最 后一次 离心后 弃掉 上 清，将 沉淀 加入0.5 % 的 甲 醛中浸 泡15 min ， 然后再 用无菌 水4000 r/min 离心5 min ，重
12、复洗 涤3次 。然 后加入 青霉 素200 U/mL 、 链霉素200 U/mL 、 卡那 霉 素100 g/mL ， 制 霉菌 素12.5 g/mL 和 两性 霉素B5.0 g/mL 过夜 ，最 后再 用无 菌水4000 r/min 离心5 min ，重复 洗涤3次 ，可 达到 无 菌效果 。 DB15/T 2503 2022 5 B B 附录B （规范 性） 培养基 制备 及捕 食线 虫性 真菌的 培养 B.1 仪器与 试剂 B.1.1 仪器设 备 生物安 全柜 （II 级） 、高 压蒸汽 灭菌 锅（ 最高 温度:135 ； 最高 压力 ：0.24 MP ）、 天平 （量 程： 500g；
13、 精度 ：0.01 g ）、 生化培 养箱 （温 度范 围：0 60 ；温 度波 动度 ：0.5 ）。 B.1.2 试剂耗 材 玉米粉 琼脂 培养 基、 三角 瓶、 称 量纸、 称量 勺、 无 菌 蒸馏水 、 锥 形瓶、90 mm 无 菌培养 皿、 打孔 器、 无菌手 术刀 、酒 精灯 。 B.2 培养方 法 B.2.1 有孔玉 米粉 琼脂 培养 基的 制备 取商品 化的 玉米 粉琼 脂培 养基 ， 经121 25 min 高 压灭菌 。 冷却至 室温 后 ， 倒入直 径为90 mm无菌 培养皿 中。 待培 养基 凝固 后，用 直径 为10 mm 的打 孔 器在培 养基 边缘15 mm 的 位
14、 置打5 个孔 ，随 后在 酒精 灯下加 热使 培养 基底 部融 化，在 孔底 部形 成约1 mm 厚度的 薄膜 ，便 于显 微镜 观察和 拍照 。 B.2.2 捕食线 虫性 真菌 的培 养 取保存 于玉 米粉 琼脂 培养 基上的 待检 捕食 线虫 性真 菌， 于 生物 安全 柜中 ， 在 菌 丝生长 均匀 处用 无 菌 手术刀 切下 直径 约为5 mm 左右的 琼脂 块， 倒置 放在 有孔玉 米粉 琼脂 培养 基的 中间， 置28 恒温 培养 箱 中培养 。 DB15/T 2503 2022 6 C C 附录C （资料 性） 被捕食 线虫 性真 菌捕 获的 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫 被捕食 线虫 性真 菌捕 获的 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫（100 x ） 见图C.1 。 图C.1 被捕 食线 虫性 真菌 捕获 的 捻转血 矛线 虫三 期幼 虫（100 x ）
