1、 ICS 65.020.20 CCS B 16 33 浙江省地方标准 DB33/T 2408 2021 甘薯茎腐 病菌检疫 鉴定方法 Detection and identification of Dickeya dadantii 2021 - 12 - 24 发布 2022 - 01 - 24 实施 浙江省市 场监督 管 理局 发 布 DB33/T 2408 2021 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB33/T 2408 2021 1 甘 薯茎腐 病菌检疫 鉴定方 法 1 范围 PCR PCR 2 规范性 引用 文件 3 术语和 定义 3.1 甘薯茎 腐病 菌 the path
2、ogen of stem and root rot of sweet potato Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacterales Pectobacteriaceae Dickeya (Dickeya dadantii) 2.36 m 0.40 m HR 注： A 4 缩略语 bp Base pair CFU Colony-Forming Unit CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside
3、triphosphate HR (Hypersensitive Reaction) MALDI-TOF MS Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry NA Nutrient Agar NGM Nutrient Agar Glycerol Media PCR Polymerase chain reaction RT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction Taq Thermus aquaticus DB33/T 24
4、08 2021 2 5 方法原 理 PCR RT-PCR 6 试剂或 材料 75 % 6.1 1 % 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 NA NGM B 6.8 PCR C 6.9 PCR D 6.10 7 仪器设 备 7.1 -80 7.2 7.3 7.4 PCR 7.5 PCR 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 1 mg 7.11 7.12 7.13 7.14 7.15 7.16 7.17 MALDI D.dadantii 7.18 8 甘薯茎 腐病 菌检 测流 程 DB33/T 2408 2021 3 1 图1 甘薯茎 腐病 菌检 测流 程图 9 症状观 察 A 1
5、0 实验室 检测 样品处 理 10.1 10.1.1 A 3 5 10 mm 10 mm 1 mL 15 min 30 min 4 8 h 12 000 r/min 10 000 g 5 min 1 mL PCR 28 2 d 3 d 10.1.2 10 20 100 mL 200 mL 4 10 000 r/min 9 000 g 20 min 1 mL 12 000 r/min 10 000 g 5 min DNA PCR PCR 100 mL 1 h 4 8 h 10 000 r/min 9 000 g 20 min 1 mL 2 3 NGM NA 3 5 DB33/T 2408 202
6、1 4 28 2 d 3 d 10.1.3 NGM NA 10 3 100 L 3 28 2 d A 10.2 10.3 NGM NA B PCR 检测 10.2 10.2.1 模板制 备 DNA CTAB DNA PCR -20 10.2.2 常规PCR 检测 PCR C PCR 10.2.3 实时荧 光PCR 检测 D 10.2.2 PCR MALDI-TOF 质谱 鉴定 10.3 MALDI-TOF MS E 致病性 测试 （可 选） 10.4 10 8 CFU/mL 1 d 25 30 12 h/12 h 2 d 4 d PCR 11 结果判 定 PCR PCR PCR 10.2.2
7、10.2.3 PCR 10.2.2 10.2.3 10.3 D.dadantii 12 样品及 检测 结果 保存 样品保 存与 处理 12.1 DB33/T 2408 2021 5 菌株保 存与 处理 12.2 结果记 录与 资料 保存 12.3 PCR DB33/T 2408 2021 6 附录A （资料 性） 甘薯茎 腐病 菌基 本信 息 A.1 症状 A.1 图A.1 甘薯茎 腐病 症状 A.2 病原菌 形态 及培 养性 状 2.36 m 0.4 m A.2 HR A.3 NA 28 2 d 2 mm 3 mm A.4 NGM 28 2 d 2 mm 3 mm A.4 DB33/T 24
8、08 2021 7 图A.2 D.dadantii 菌 体形 态图 图A.3 烟草过 敏性 反应 DB33/T 2408 2021 8 图A.4 D. dadantii 在 培养 基上 的菌落 形态 注： NA NGM A.3 接种症 状 10 8 CFU/mL 1 d 25 30 2 d 4 d A.5 PCR 图A.5 甘薯藤 蔓上 的接 种症 状 注： DB33/T 2408 2021 9 附录B （规范 性） 培养基 B.1 NA 培 养基 （1L ） B.1.1 10 g B.1.2 5 g B.1.3 5 g B.1.4 3 g B.1.5 15 g B.1.6 1 000 mL
9、B.1.7 pH 7.0 7.2 121 15 min B.2 NGM 培 养基 （1 L ） B.2.1 Becton Dickinson and Company Sparks, MD 23 g B.2.2 1 % v/v 10 mL B.2.3 0.4 g B.2.4 pH 6.5 121 10 min DB33/T 2408 2021 10 附录C （规范 性） 常规PCR 检 测方 法 C.1 引物及 序列 Ddad5 5 -gtctgcagagcagtatcaatc-3 / Ddad9 5 -aaacttcaacggcaaagcg-3 C.2 反应体 系 25 L 10 PCR Bu
10、ffer 2.5 L Mg 2+ 2 L dNTP 10 mmol/L 2 L 10 mol/L 1 L DNA 1 L Taq 0.2 L 1 u ddH2O 15.3 L C.3 反应程 序 PCR 94 3 min 94 30 s 55 1 min 72 1 min 30 72 5 min C.4 琼脂糖 凝胶 电泳 分析 PCR 1.5 % 222 bp C.5 结果判 定 DB33/T 2408 2021 11 附录D （规范 性） 实时荧 光PCR 检 测方 法 D.1 引物、 探针 及序 列 D.1.1 Ddad3 5 -acccaggccaccagaagt-3 / Ddad4
11、5 -gacggtactgttaccgctac-3 D.1.2 TaqMan ADdad 5 -FAM-cagtggtgcctgcgccaac-MGB -3 D.2 反应体 系 25 L PCR Premix 12.5 L Ddad3 5 mol/L 1 L Ddad4 5 mol/L 1 L TaqMan 10 mol/L 1 L ROX Reference Dye II 0.5 L DNA 1 L ddH2O 8 L D.3 扩增程 序 95 10 s 95 15 s 63 1 min 40 D.4 结果判 定 Ct 35 35 Ct 40 DNA 2 L 5 L Ct 35 DB33/T 2408 2021 12 附录E （规范 性） MALDI-TOF-MS 鉴定 E.1 样品的 准备 和鉴 定 NA 28 24 h (HCCA) 1 L MALDI-TOF 2 000 20 000 BioTyper MBT E.2 结果判 定 MALDI-TOF MS 2.300 3.000 2.000 2.299 1.700 1.999 0.000 1.699 Bruker MBT D. dadantii 2.000
