1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 2905 2022 猪A 型塞内卡病毒 分离鉴定 技术规范 Technical specification for isolation and identification for swine senecavirus A 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 29052022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 试剂与设备.1 主要试剂.1 5.1 主要仪器设备.2 5.2 6 样品的采
2、集、保存与运输.2 样品采集.2 6.1 保存与运输.2 6.2 7 病毒的细胞分离培养.2 生物安全措施.2 7.1 样品的处理.2 7.2 单层细胞制备.2 7.3 样品接种.3 7.4 病毒收获.3 7.5 8 病毒核酸鉴定.3 RT-LAMP和RT-PCR引物.3 8.1 核酸提取和反转录.3 8.2 RT-LAMP反应.3 8.3 RT-PCR 反应.4 8.4 试验结果观察.4 8.5 9 结果判定.5 RT-LAMP.5 9.1 RT-PCR.5 9.2 病毒分离鉴定.5 9.3 附录A（规范性）试剂配置.6 附录B（资料性）猪A型塞内卡病毒VP1蛋白基因 LAMP和RT-PCR
3、 扩增序列.7 DB51/T 29052022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本文件主要起草人：陈弟诗、徐志文、陈斌、朱玲、张毅、裴超信、陈冬、邱明双、梁璐琪、李淳、翁周、谢伟、邱凌、李波、彭晔、陈岗、魏秋霞、李英林、孙贤刚、彭珂楠、鲁令华。本文件首次发布。DB51/T 29052022 1 猪 A 型塞 内卡病毒 分离鉴 定技术规 范 1 范围 本文件规定了猪A型塞内卡病毒分离鉴定方法、RT-LAMP及 RT
4、-PCR诊断方法。本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定、实验室诊断、病毒检测、流行病学调查。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和 定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变 DMEM：细胞营养液 DNA marke
5、r：DNA相对分子质量标记 FBS：胎牛血清 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 PBS：磷酸缓冲液 PK-15：猪肾细胞 RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 SVA：猪A型塞内卡病毒 5 试剂与 设备 主要试 剂 5.1 5.1.1 所用生化试剂均为分析纯。5.1.2 实验用水应符合 GB/T 6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。5.1.3 PK-15细胞、DMEM培养基、胰蛋白酶、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、0.01 mol/L pH 7.07.4 DB51/T 29052022 2 PBS（参见附录A）；RNA提取试剂盒、反转录
6、试剂盒、PCR反应混合液（2）、LAMP反应各组分试剂。主要仪 器设 备 5.2 微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、恒温水浴槽或恒温金属浴、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。6 样品的 采集、保 存与 运输 样品采 集 6.1 6.1.1 水泡液 采集 用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5 mL1 mL，并将水泡液装入保存管，加青霉素至终浓度1000 IU/mL、链霉素至终浓度500IU/mL，不能立即使用应置于-70冷冻保存；6.1.2 水泡皮 采集 用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取
7、水泡皮2g5g，装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，不能立即使用应置于-70冷冻保存；6.1.3 其他组 织样 品采 集 若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织或淋巴结、肺脏、扁桃体、肠道等组织5g10g，装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，不能立即使用即放于-70冷冻保存。保存与 运输 6.2 采集的样品应按照NY/T 541要求包装和运输。7 病毒的 细胞 分离 培养 生物安 全措 施 7.1 SVA分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB 19489（所有部分）的规定执行。样品的 处理 7.2
8、 7.2.1 水泡液 样品 处理 水泡液4 3000 r/min离心10min，以0.22m无菌滤膜过滤除菌后，-70保存备用；7.2.2 水泡皮 及其 他组 织样 品处 理 取0.5g待检组织样品，加入1mL1.5mL PBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4 3000 r/min离心10min，取上清液，以0.22 m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5 mL离心管中，-70 保存备用。单层细 胞制 备 7.3 DB51/T 29052022 3 按常规方法将PK-15细胞分装在25 cm2细胞培养瓶中，每瓶加入含8%FBS的 DMEM 培
9、养基5mL，细胞浓度应为2105个/mL3105个/mL，培养48h。，37、5%CO2条件下培养48 h。样品接 种 7.4 取处理后的样品上清液0.2 mL接种到生长状况良好的单层PK-15细胞上（5mL工作体积）。每份样品接种2瓶4瓶细胞，另设细胞对照2瓶4瓶。37 C吸附1 h，弃上清，加入5 mL含2%FBS的DMEM培养基，37 C、5%CO2条件下培养48 h。病毒收 获 7.5 每天观察记录CPE，通常在接种48 h后可出现CPE，主要呈现细胞变圆，空泡增加，有死细胞漂浮在液面，最后溶解脱落。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，
10、4 C 3000 r/min离心10 min，收获病毒上清液，置-70 C保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现明显CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层PK-15细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4 mL细胞维持液，37 C培养。如此盲传3代5代，再进行鉴定。8 病毒核 酸鉴 定 RT-LAMP 和RT-PCR 引物 8.1 RT-LAMP和RT-PCR引物针对SVA VP1蛋白基因保守区域，引物序列见表1。表1 引物序 列 检测方法 引物 序列(53)位置(bp)RT-LAMP SVV F3 CCGATCTCGACTACTGAATG 286628
11、86 SVV B3 GAGAACGCCACTGTCAGAC 30173036 SVV FIP CATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC 28812941 SVV BIP TTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC 29533013 RT-PCR SVV F TACAGTTTGGCCTGTTTCACT 30633083 SVV R CGCCCAGTAAAGTGGTAGGG 32103229 核酸提 取和 反转 录 8.2 采用RNA提取试剂盒提取处理后的临床样品或收集到的细胞/病毒液核酸，或用自动化核酸提取仪提取，并使用
12、反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20保存备用。RT-LAMP 反应 8.3 8.3.1 RT-LAMP 反 应体 系 反应体系中各组分见表2，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。DB51/T 29052022 4 表2 RT-LAMP 反 应体 系 反应试剂 体积（L）BstDNA聚合酶缓冲液 2.5 RNA酶抑制剂（40 U/L）0.5 反转录酶（200 U/L）0.75 BstDNA聚合酶 1 甜菜碱（1mmol/L）2 MgSO4（8mmol/L）2 引物F3/B3（0.2mol/L）各2 引物FIP/BIP（1.6mol/L）各4 dNTPs（1.4mmol/L）2 RN
13、A模板 1 ddH2O 1.25 8.3.2 RT-LAMP 反 应程 序 将8.4.1配制的反应体系置于65 C水浴或金属浴中反应45 min，再置于80 C反应10 min，产物4 C保存。RT-PCR 反应 8.4 8.4.1 RT-PCR 反 应体 系 反应体系见表3，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。表3 RT-PCR 反 应体 系 PCR反应试剂 体积（L）2TaqPCRmaster Mix 5 上游引物：F（10 mol/L）0.5 下游引物：R（10 mol/L）0.5 cDNA模板 1 ddH2O 3 8.4.2 RT-PCR 反 应程 序 反应程序见表4。表4 RT-P
14、CR 反 应程 序 步骤 时间和温度(min、s/C)循环数(个)预变性 5 min、95 C 1 变性 30 s、95 C 35 退火 30 s、56 C 延伸 30 s、72 C 延伸 7 min、72 C 1 试验结 果观 察 8.5 8.5.1 RT-LAMP 显 色反 应 在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料SYBR Green I 0.5 L，涡旋混匀，在紫外光下观察。8.5.2 琼脂糖 凝胶 电泳 成像 DB51/T 29052022 5 取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。9 结果判 定 RT-LAMP 9.1 阳性对照出现1条梯状条带并发出绿色
15、荧光，阴性对照无条带不显色，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照一致条带，且显色反应样品管发出绿色荧光，判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果无条带，显色反应样品管无绿色荧光变化，判定为SVA核酸阴性。RT-PCR 9.2 阳性对照出现大小为167 bp的特异性扩增条带，阴性对照无条带，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照大小一致的特异性扩增条带，则判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩增条带，则判定为SVA核酸阴性。病毒分 离鉴 定 9.3 9.3.1 对核酸阳性扩增产物进行测序，并将测序结果与附录 B.2序列比对，进行确认；9.3.2 若细胞发生 CPE，同时 8.1
16、 或 8.2 鉴定结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为 SVA 分离鉴定阳性。9.3.3 若盲传 3 代后，细胞并未发生 CPE，但 8.1 或 8.2 鉴定结果为阳性，则继续盲传至 5 代后，再进行RT-LAMP或 RT-PCR核酸鉴定，若8.1或 8.2鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为SVA 分离鉴定阳性；若 8.1或8.2鉴定结果变为阴性，则判定为SVA 分离鉴定阴性。9.3.4 若盲传 3 代后，细胞并未发生 CPE，且 8.1 或 8.2 鉴定结果为阴性，则判定为 SVA 分离鉴定阴性。DB51/T 29052022 6 A A 附录A（规范 性）试剂配 置 A.1
17、.01 mol/L pH 7.07.4 PBS NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 3.58 g KH2PO4 0.27 g 灭菌双蒸水 800 mL NaOH或者HCl调pH值7.07.4，灭菌双蒸水定容至1000 mL,121、15 min高压锅灭菌冷却，置常温或4备用。A.2 电泳缓 冲液 TAE（50 倍）三羟甲基甲烷碱（Tris base）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100 mL 蒸馏水 100 mL 待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000 mL，置4冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用
18、作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。A.3 1.0%琼 脂糖 凝胶 板制 备 琼脂糖 1.0 g 1 TAE缓冲液 100 mL 0.5 ug/mL GoldView 5 uL 微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5 mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4 mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。DB51/T 29052022 7 B B 附录B（资料 性）猪A 型 塞内 卡病 毒VP1 蛋 白基 因LAMP 和RT-PCR 扩 增序列 B.1 猪 A 型 塞内 卡病 毒 VP1 蛋 白，外 引 物F3、B3 扩
19、增 序 列 CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGGACGCCGTCTTCCCCCGTCCTTTCCCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCCCGCCCAACAGTCGCTTCCCGACCCGCTACTCGTTTCGGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTGGCGTTCTC B.2 猪A 型 塞内 卡病 毒 RT-PCR 引物扩 增序 列 TACAGTTTGGCCTGTTTCACTTACTTTAGATCAGACCTTGAAGTCACGGTGGTCTCACTGGAGCCAGATTTGGAATTCGCCGTGGGGTGGTTCCCCTCTGGCAGTGAGTACCAGGCTTCTAGCTTTGTCTATGACCAGCTGCATGTACCCTACCACTTTACTGGGCG
