1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 28352022 马驽巴贝斯虫检测 PCR 法 PCR method for detection of babesiosis caballi 2022-12-08 发布2023-01-08 实施 内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 28352022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。本文件主要起草人
2、：陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。DB15/T 28352022 1 马驽巴贝斯虫检测 PCR 法 1 范围 本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本
3、文件。马驽巴贝斯虫 babesiosis caballi 马驽巴贝斯虫是引起马驽巴贝斯虫病的病原体，是一种寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的血液原虫。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction；PCR 用于扩增位于已知序列之间DNA（deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸）的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（deoxyribo nucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）
4、为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经2530个扩增循环，扩增倍数达到106。实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct 值 cycle threshold DB15/T 28352022 2 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trithyl ammonium bromide)DNA:脱氧核糖核酸
5、（deoxyribonucleic acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane 5 试剂与材料 水：符合 GB/T 6682 的要求。DNA 提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl(pH 8.0)。NaCl。EDTA
6、。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。Taq 酶。dNTP（2.5 mmol/L）。PCR buffer。DNA 分子量标准（DNA Marker）（50 bp500 bp）。实时荧光 PCR 预混液。阳性对照样品：采用已知含有马驽巴贝斯虫的 DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录 B。阴性对照样品：采用已知不含有马驽巴贝斯虫的 DNA。空白对照：ddH2O。引物及探针:见表 1。DB15/T 28352022 3 表1 马驽巴贝斯虫检测引物及探针 6 仪器与设备 PCR 仪。凝胶成像仪。实时荧光 PCR 仪。高速台式离心机（最高转速 12000 rpm）。旋涡
7、振荡器（最高转速 3000 rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平（感量 0.01 g）。单孔道微量移液器：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L。7 样品采集 使用添加EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。8 检测方法 PCR 法 8.1.1 样品的总 DNA 提取 参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的血液DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260/A280在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。8.1.2 PCR 扩增 反应体系为50 L，
8、体系组成见表2。检测方法 引物/探针 序列（5-3）扩增片段 PCR法 上游引物（F）5-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3 200bp 下游引物（R）5-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3 实时荧光PCR法 上游引物（F）5-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3 200bp 下游引物（R）5-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3 探针（P）5-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3 DB15/T 28352022 4 表2 PCR 扩增反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 反应体系体积L 10Buffer(含 Mg2+)5
9、Taq 酶 5 U/L 0.25 dNTP 2.5 mmol/L 5 上游引物（F）10 mol/L 2 下游引物（R）10 mol/L 2 模板 2 ddH2O 补足至 50 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。8.1.3 PCR 反应条件 预变性：95，3 min；变性：95，30 s；延伸退火：58，1 min，35个循环；72 延伸5 min；4 保存。8.1.4 PCR 扩增产物电泳检测 用TBE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1TBE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5 L8 L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9 V/cm恒压
10、电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。8.1.5 结果判定与表述 8.1.5.1 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)阳性对照:出现 200 bp 的特异性条带；b)阴性对照：不出现 200 bp 的特异性条带；c)空白对照：不出现 200 bp 的特异性条带。8.1.5.2 结果判定 8.1.5.2.1 质控对照成立条件下，两个平行样品均出现 200 bp 的特异性条带为阳性。8.1.5.2.2 质控对照成立条件下，两个平行样品均不出现 200 bp 的特异性条带为阴性。8.1.5.3 结果表述 8.1.5.3.1 PCR 产物为阳性者，
11、表述为“检出马驽巴贝斯虫”。8.1.5.3.2 PCR 产物为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。实时荧光 PCR 检测 8.2.1 样品的总 DNA 提取 同7.1.1操作。8.2.2 荧光定量 PCR 扩增 DB15/T 28352022 5 反应体系体积为25 L，见表3。表3 荧光定量 PCR 扩增反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度mol/L 反应体系体积L PCR 反应预混合液 12.5 上游引物（F）10 1 下游引物（R）10 1 探针（P）10 1 模板 2 ddH2O 补足至总体积为 25 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。8.2.3 反应条件 预变性：95，
12、3 min；变性：95，15 s；延伸退火：58，1 min，40个循环。在58 时收集荧光信号值。8.2.4 结果判定与表述 8.2.4.1 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 40.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 40.0；c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 35.0。8.2.4.2 结果判定 8.2.4.2.1 质控对照成立条件下，2 个平行样检测结果 Ct 值大于等于 40.0，可判定被检样品为阴性。8.2.4.2.2 质控对照成立条件下，
13、2 个平行样检测结果 Ct 值小于等于 35.0，可判定被检样品为阳性。8.2.4.2.3 质控对照成立条件下，至少 1 个平行样检测结果 Ct 值 35.040.0，并出现典型的扩增曲线，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct 值小于 40.0，并出现典型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果 Ct 值大于等于 40.0，可判定被检样品为阴性。8.2.4.3 结果表述 8.2.4.3.1 检测结果为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。8.2.4.3.2 检测结果为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。9 防止交叉污染措施 检测过程中防止交叉污
14、染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。DB15/T 28352022 6 A A 附录A （资料性）溶液配制及提取方法 A.1 CTAB-提取缓冲液 将5 g CTAB，20.45 g NaCl，3.03 g Tris，1.86 g Na2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调 pH 8.0后，定容至250 mL，115 高压15 min。A.2 CTAB-沉淀液 称0.2 g CTAB,0.234 g NaCl，定容至100 mL，115 高压15 min。A.3 1.2 mol/L NaCl 溶液：称取28 g NaCl，定容至400 mL，115 高压15 min。A.4 DN
15、A 提取方法：A.4.1 称取样品0.5 g1 g加入1.5 mL3.5 mL CTAB提取液中，再加入12 L20 L蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65 至少1 h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1 mL，最多10 mL。A.4.2 4000 rpm/min5000 r/min离心10 min。A.4.3 将上清（约1 mL）加入无菌EP中（2 mL管），加入700 L氯仿，涡旋30 s后，再12000 rpm离心10 min。A.4.4 取上清600 L650 L加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混
16、匀，室温静置1 min。A.4.5 12000 rpm离心10 min，去上清。沉淀溶解于350 L的1.2 mol/L NaCl溶液。（2管合并共用350 L溶液）。A.4.6 加入 350 L氯仿，涡旋30 min，12000 rpm离心10 min。A.4.7 取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20 min，12000 rpm离心10 min，去上清，沉淀用500 L 75%的乙醇洗涤，再12000 rpm离心10 min。A.4.8 去上清后，干燥沉淀，60 下15 s20 s（开盖倒立）。A.4.9 将沉淀溶于100 L灭菌水或TE buffer或DEPC水中。DB15/T 28352022 7 B B 附录B （规范性）马驽巴贝斯虫的目标扩增序列 CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCTTGAGGCTAAGTACCAACCGCTGACCCTTCCTGACCCCTACCAGTTGGAGGCCGCTTTTATACTCTTCAAGGAGAGTGGCGCTAATCCGGCCAATAGCGCTGAGAAGCGTTTCTGGATGCGTTTCAAAAGGGGCAAGAACCACAGTTACTTCCACGACTTAGTCTTCAATCTGCTG
