1、 ICS 65.020.20 CCS B 16 22 吉林省地方标准 DB22/T 36012023 人参锈腐病菌分子检测 实时荧光定量 PCR法 Detection of Ilyonectria robusta causing ginseng rusty root rot by quantitative real-time PCR 2023-12-28 发布2024-02-01 实施吉林省市场监督管理厅发 布 DB22/T 36012023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本
2、文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学、吉林参王植保科技有限公司。本文件主要起草人：陈长卿、姜云、高洁、徐怀友、卢宝慧、杨丽娜、姜伊琳。DB22/T 36012023 1 人参锈腐病菌分子检测 实时荧光定量 PCR 法 1 范围 本文件确立了人参锈腐病菌实时荧光定量 PCR 分子检测方法，给出了实时荧光定量 PCR 检测原理，规定了试剂和材料、仪器设备、样品采集与制备、分析步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。本文件适用于人参根和土壤中锈腐病菌的实时荧光定量 PCR 分子检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范
3、性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 28067 甘蔗黄叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 3 术语和定义 GB/T 28067 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。人参锈腐病 ginseng rusty root rot 一种主要由强壮土赤壳菌（Ilyonectria robusta）侵染人参根部导致的土传病害。实时荧光定量 PCR 法 quantitative real-time PCR 一种在 DNA 扩增反
4、应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。来源：GB/T 280672011，2.3 4 原理 根据人参锈腐病强壮土赤壳菌 I.robusta 组蛋白 Histone 基因的保守序列设计一对特异性引物进行 PCR 扩增反应。利用荧光信号伴随目的 PCR 产物的增加而增强的原理，收集 PCR 扩增过程的荧光信号值。随着 PCR 扩增反应的进行，Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，根据 Ct 值判断供试样品是否含有人参锈腐病强壮土赤壳菌。5 试剂和材料 DB22/T
5、 36012023 2 通用要求 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试剂 5.2.1 水，GB/T 6682，一级。5.2.2 植物基因组 DNA 提取试剂盒。5.2.3 土壤总 DNA 提取试剂盒。5.2.4 实时荧光定量 PCR 试剂盒。引物 5.3.1 引物序列 上游引物：5-CCGCCGACCTGACCTGACCGTCCGCC-3，下游引物：5-ATGATGTTTGATGCGAGACGTAA-3。5.3.2 引物配制 引物用水稀释成 10 mol/L，-20 保存备用。6 仪器设备 天平：感量 0.001 g。实时荧光定量 PCR 仪：激发/检测波长范围 350 nm750
6、nm，可用荧光染料（SYBR Green）；升降温速度3.0/s；均一性0.5；准确性0.3；温度范围 4 100。高压灭菌锅：125 kPa。离心机：离心转速 12 000 rpm 以上。冰箱：4，-20，-80。微量移液器：0.1 L2.5 L，2 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。涡旋振荡器。粉碎机。7 样品 对照样品 7.1.1 阳性样品 人参锈腐病强壮土赤壳菌菌丝体 DNA。7.1.2 阴性样品 7.1.2.1 经分子检测 3 次未检出强壮土赤壳菌的健康人参根基因组 DNA。7.1.2.2 经分子检测 3 次未检出强壮
7、土赤壳菌的土壤总 DNA。7.1.3 空白样品 DB22/T 36012023 3 无菌一级水。样品采集与制备 7.2.1 人参 采集新鲜人参根，装入密封袋，置于冰盒中，在实验室用研磨机将参根打碎，充分混合，4 保存不超过 12 h，也可-80 长期保存。7.2.2 土壤 每 25 m2 人参田块采用梅花形采样法，不少于 5 点，每个点取人参根际土壤样品 50 g，装入密封袋，充分混合，置于冰盒中，4 保存不超过 12 h，也可-80 长期保存。8 分析步骤 基因组 DNA 提取 准备人参根样品和土壤样品，参照基因组 DNA 提取试剂盒说明要求提取基因组 DNA。采用核酸蛋白分析仪测定 DNA
8、 浓度和纯度。当 DNA 浓度为 100 ng/L 200 ng/L，A260/A280 比值为 1.82.0 之间时，DNA 模板适宜荧光定量 PCR 扩增。用无菌一级水将模板 DNA 浓度稀释成 50 ng/L 用于荧光定量 PCR 扩增。实时荧光定量 PCR 反应 8.2.1 反应体系 反应体系见表 1。表1 实时荧光定量 PCR 反应体系 试剂 体积（L）2SYBR Green Mix 10.0 正向引物（10 mol/L）0.2 反向引物（10 mol/L）0.2 DNA 模板 1.0 二甲基亚砜 DMSO 1.0 一级水 7.6 总体积 20.0 8.2.2 反应程序 按照商品化试
9、剂盒说明书进行荧光定量 PCR 反应，每个样品重复 3 次。8.2.3 质量控制 扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性对照荧光值的 15%，表明反应体系工作正常。否则，表明 PCR 反应体系不正常，应重新进行检测。DB22/T 36012023 4 9 结果判定与表述 结果判定 在 PCR 反应体系正常工作的前提下，Ct 值30 为阴性，30 为阳性。结果表述 样品中检出或未检出人参锈腐病菌。10 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理 30 min 后再弃置；防止交叉污染的措施按照 GB/T 28067 的规定执行。
