1、ICS 67.120.10CCS X 22DB36江西省地方标准DB36/T 18812023黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范Technical specification for isolation and identification of Elizabethkingia miricola inRana nigromaculata2023-11-20 发布2024-05-01 实施江西省市场监督管理局发 布DB36/T 18812023I目 次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语与定义.14设备和材料.15培养基和试剂配制.26分离与鉴定技术流程.27操作步骤.28回归感
2、染.49菌种保存及生物安全.4附录 A（资料性附录）设备和材料.5附录 B（资料性附录）培养基和试剂配制.6DB36/T 18812023II前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、南昌大学、江西省农业技术推广中心。本文件主要起草人：刘文舒、郭小泽、王玉柱、李思明、简少卿、李小勇、陈彦良、唐艳强、肖海红。DB36/T 188120231黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范1
3、范围本文件规定了黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定的设备和材料、培养基和试剂配制、分离与鉴定技术流程、操作步骤、回归感染和菌种保存及生物安全。本文件适用于黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定，其他蛙类米尔伊丽莎白菌分离鉴定可参考实施。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19489实验室生物安全通用要求动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（2022年1月7日农业农村部令2022年第1号
4、修订）3术语与定义下列术语与定义适用于本文件。3.1双毁髓法Double pithing毁髓针刺入蛙枕骨大孔后，将针后端压平，水平向前进入蛙颅腔，左右摆动，捣毁双侧脑组织。将针抽出至枕骨大孔处，水平向后进入脊椎管，前后滑动捣毁脊髓。3.2聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction,PCR在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是由高温变性、低温退火和中温延伸反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以快速进行扩增。3.3基因测序 Gene sequencing基因测序是对基因序列上的碱基排列进行解析的过程。3.4回归感染 Recurrent infectionDB36/
5、T 188120232实验室中通过人工手段，将某些分离得到的病原体（如细菌、病毒等）重新注入动物体内，观察动物发病情况。4设备和材料设备和材料见附录A。5培养基和试剂配制培养基和试剂配制见附录B。实验室用水规格和试验方法参照GB/T 6682执行。6分离与鉴定技术流程图 1黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术流程DB36/T 1881202337操作步骤7.1采样7.1.1病蛙采集回实验室后，用清水清洗蛙体。7.1.2对病蛙进行双毁髓法操作。7.1.3待病蛙完全进入死亡状态后，用酒精棉球（75%酒精）对病蛙体表和眼部消毒。7.1.4将杀菌消毒后的病蛙置于无菌操作台内的托盘上，用镊子和手术剪刀进
6、行解剖，取出眼部、脑部、肝、脾、肾组织。7.2病菌的培养7.2.1在无菌状态下将所采组织进行剪碎或匀浆。7.2.2将剪碎或匀浆后的组织液与营养肉汤按照 1:10 比例进行混合，恒温培养箱（28 1）振荡（180 r/min）培养 24 h。7.2.3将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于营养琼脂中，恒温培养箱（28 1）培养 24 h，观察。7.2.4选取优势菌落接种于新的营养琼脂，恒温培养箱（28 1）培养 24 h，待进一步鉴定。7.3病菌样品的鉴定7.3.1形态学鉴定菌落颜色为米色或淡黄色，边缘整齐，半透明，表面湿润、光滑。7.3.2分子生物学鉴定7.3.2.1 PCR 模板
7、的制备接种环挑选培养基上待检菌落，置于0.5 mL灭菌生理盐水中，4000 r/min离心2 min，弃上清；再加0.5 mL无菌水重悬并涡旋混匀，100 沸水中煮沸10 min后，移至冰面上，冷却后4000 r/min离心30 s，取上清液作为PCR模板待用。7.3.2.2 PCR 反应体系的配制按照10PCR buffer 2 L，dNTP mix 2 L，上下游引物各0.5 L（10 mol/L），Taq酶(2.5 U/L)0.2L，菌液2 L，ddH2O 12.8 L配制20 L PCR反应体系。7.3.2.3 PCR 反应条件16S rDNA扩增条件：95 预变性5 min，94 变
8、性30 s，55 退火30 s，72 延伸90 s，共32个循环，最后72 延伸10 min。gyrB基因扩增条件：95 预变性5 min，94 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸30 s，共32个循环，最后72 延伸10 min。7.3.2.4 电泳及成像观察取5 L PCR扩增产物和1 L上样缓冲液，混匀后加入1.2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白孔加入5 L Marker标准品。电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上，打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像观察，确定PCR效果。DB36/T 1881202347.3.2.5 基因测序将扩增产物进行基因测序，在NCBI（http
9、s:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对，与已有基因同源性高于98%即可确定为米尔伊丽莎白菌。8回归感染将分离的米尔伊丽莎白菌在营养肉汤中振荡培养24 h，4000 r/min离心10 min沉淀菌体，去上清后用无菌pH 7.2的无菌磷酸缓冲液（1PBS）稀释成浓度为1106、1107、1108 cfu/mL。每个稀释梯度通过腹腔注射到健康蛙（0.2 mL/只），用1PBS缓冲液作对照。常规管理15天，观察记录患病死亡情况，从产生典型白内障病症状的感染蛙再次进行细菌分离，经16S rDNA和gyrB基因分子鉴定，所分离的细菌与米尔伊丽莎白菌（E.miricola）同源性达到98%
10、以上，则证实分离的病原菌确定为黑斑侧褶蛙白内障的致病菌。9菌种保存及生物安全为了保护实验室人员的安全，应由具备专业知识的人员进行检测，所有培养物和废弃物参照GB/T19489及国家有关规定执行。菌种应由具备专业相关资质的实验室根据动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法进行妥善保存。DB36/T 188120235附录A（资料性附录）设备和材料A.1 设备无菌工作台、手持式均质器（适用于 1.5 mL 离心管）、恒温培养箱、恒温水浴锅、高速冷冻离心机（最大转速12000 r/min）、微波炉、涡旋仪、PCR 仪、电泳仪、自动凝胶成像系统、电子天平（最小刻度 0.01 g）、冷藏（4）和冷冻（-20
11、）功能的冰箱等。A.2 材料剪刀、一次性接种环、三角瓶、无菌培养皿（直径 90 mm）、微量加样器（1 L、2.5 L、10 L、100 L 和 1000 L）、Tip 头（与微量加样器相匹配）、PCR 管（0.2 mL）、1.5 mL 和 2.0 mL 无菌离心管等。DB36/T 188120236附录B（资料性附录）培养基和试剂配制B.1 营养肉汤成分：蛋白胨10.0 g/L；酵母粉5.0 g/L；氯化钠10.0 g/L；pH值7.2 0.2（25）。制作方法：将上述成分混合，加入双蒸水或去离子水中，调整pH值至7.2 0.2，滤清，分装，121 灭菌15 min。B.2 营养琼脂成分：蛋
12、白胨10.0 g/L；酵母粉5.0 g/L；氯化钠10.0 g/L；琼脂15.0 g/L；pH值7.2 0.2（25）。制作方法：将上述成分混合，加入双蒸水或去离子水，调整pH值至7.2 0.2，121 灭菌15 min，冷却至50 左右时在无菌状态下倾注适量液态培养基至细菌培养平板中冷却，备用。B.3 1.2%琼脂糖凝胶称取1.2 g琼脂糖，加入100 mL 1TAE缓冲溶液中，加入核酸染料，微波炉加热至完全融化，依据样品数选用适宜的梳子，将琼脂糖倒入凝胶盘中，胶板厚度要均匀，0.5 cm左右。待凝胶冷却后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加入1TAE缓冲溶液淹没胶面。B.4 50TAE 缓冲
13、溶液取242 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸，100 mL 0.5 M EDTA（pH8.0），加纯水至1000 mL，备用。B.5 1TAE 缓冲溶液将50TAE缓冲溶液1份加入49份蒸馏水，混匀，备用。B.6 引物配制将合成的16S rDNA和gyrB引物用双蒸水稀释成10 mol/L。16S rDNA上游引物序列：27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物序列：1492R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，扩增片段长度约1500 bp。gyrB基因上游引物序列：gyrB3F 5-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3，下游引物序列：gyrB14R 5-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3，扩增片段长度约1200 bp。B.7 其他试剂（商品化试剂）灭菌生理盐水、PBS缓冲液、双蒸水、10PCR缓冲液、Taq 聚合酶（0.5 U/L）、dNTPs（2 mmol/L）、DNA Marker（DL 2000）、上样缓冲液、核酸染料（GelRed）等。_
