1、NY 3291997 前 言 本标准根据农业部1993 年下达的制定行业标准苹果无病毒苗木繁育规程计划编制。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由中国农业科学院果树研究所、河北农业大学、农业部农业司、山东省农业厅果茶站、辽宁省农业厅果蚕站负责起草。 本标准主要起草人：王国平、马宝、史光瑚、孔庆信、孙守友、洪霓。 1 范围 本标准规定了苹果无病毒苗木的质量要求，适用于全国各苹果苗木产地及栽培区。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探
2、讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB 837087 苹果苗木产地检疫规程 GB 984788 苹果苗木 GB 1294391 苹果无病毒母本树和苗木检疫规程 3 定义 本标准采用下列定义。 3.1 苹果无病毒母本树 指用苹果无病毒原种材料繁育的用于提供品种接穗或营养系砧木的母株。 3.2 苹果无病毒砧木 指用无病毒无性系砧木母本树材料繁育的无性系砧木或未经嫁接的实生砧木。 3.3 苹果无病毒苗木 指用无病毒接穗和无病毒砧木繁育的苹果嫁接苗或用无病毒材料通过组织培养方法繁殖的苹果自根苗。 4 质量要求 页码，1/6NY 32919972006-3-29file:/C:Inetpubwwwroo
3、tdatagbnN329000A.htm4.1 不带下列病毒及类病毒。 4.1.1 苹果绿皱果病毒 Apple green crinkle virus。 4.1.2 苹果锈果类病毒 Apple scar skin viroid。 4.1.3 苹果花叶病毒 Apple mosaic virus。 4.1.4 苹果褪绿叶斑病毒 Apple chlorotic leafspot virus。 4.1.5 苹果茎痘病毒 Apple stem pitting virus。 4.1.6 苹果茎沟病毒 Apple stem grooving virus。 4.2 不带GB 8370中规定的检疫对象。 4.3
4、 苗木规格符合GB 9847标准的质量要求。 5 检测方法 5.1 田间症状鉴定法 5.1.1 苹果绿皱果病毒、锈果类病毒和花叶病毒三种显性病毒在苹果树上有明显症状，可直接在田间进行观察。 5.1.2 三种显性病毒在苹果树上的症状见表1。 表 1 5.2 指示植物检测法 5.2.1 苹果褪绿叶斑病毒、茎痘病毒、茎沟病毒三种潜隐病毒和花叶病毒、锈果类病毒可采用木本指示植物检测法。 5.2.2 检测上列五种病毒的木本指示植物是： 病毒种类 主 要 症 状苹果绿皱果病毒病株的幼果表面出现水渍状斑块，逐渐发展为凹凸不平畸形果，病部果皮逐渐形成木栓化呈锈色苹果锈果类病毒锈果型：先从顶部出现淡绿色水渍状斑
5、块，最后向果梗扩展成栓化锈斑与纵纹。 花脸型：果实着色后表现红绿相间花脸状。 锈果-花脸复合型：呈现有锈斑又有花脸的复合症状。苹果花叶病毒斑驳型：从小叶脉开始发生鲜黄色病斑，形状不规则，大小不一。 环斑型：病树叶上产生圆形或椭圆形黄色环斑。 花叶型：病斑不规则，有较大的深绿、浅绿相间色。 条斑型：病树叶片沿叶脉失绿黄化。 镶边型：病叶片的边缘发生黄化页码，2/6NY 32919972006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN329000A.htm a）苏俄苹果（R 12740-7A）：检测苹果褪绿叶斑病毒； b）司派227（Spy 227）或光辉（Radian
6、t）：检测苹果茎痘病毒； c）弗吉尼亚小苹果（Virginia crab）：检测苹果茎沟病毒； d）兰蓬王（Lord lambourne）：检测苹果花叶病毒； e）国光（Ralls）：检测苹果锈果类病毒。 5.2.3 五种病毒在木本指示植物上的主要症状表现见表2。 表 2 5.2.4 木本指示植物检测法可在田间和温室内进行，其操作步骤分别见附录 B和附录C。 5.3 血清学检测法 5.3.1 本法采用A蛋白酶联免疫吸附法（PAS-ELISA），其操作步骤见附录A。 5.3.2 凡能制备出抗血清的苹果病毒均采用本法进行检测。 6 检验规则 病毒种类 指示植物症状苹果褪绿叶斑病毒5月中下旬以后，在
7、苏俄苹果叶片上出现褪绿斑点，多发生于叶片一侧，病株叶 片较健株叶片小。有的向一侧弯曲呈舟形叶，植株矮化，或生长衰弱 苹果茎痘病毒5月中下旬以后，在光辉指示植物上出现叶片反卷，植株矮化。在Spy 227指示植 物上出现叶片反卷、皮层坏死等症状 苹果茎沟病毒 只在费吉尼亚小苹果上表现症状，病株较健株矮小，叶片小而色淡，有的病株嫁 接口周围肿胀，接合部内有深褐色坏死环纹。木质部产生深褐色纵向陷条沟，严 重时从外部即可辨认。在温室鉴定中，表现叶部黄斑或环状斑、叶片扭曲变形 苹果花叶病毒叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑 苹果锈果类病毒弯叶和茎干锈斑、坏死斑 页码，3/6NY 32919972006-3-29f
8、ile:/C:InetpubwwwrootdatagbnN329000A.htm6.1 检验步骤 6.1.1 档案核查：在进行病毒抽样检测之前，要检查无病毒苗圃是否有无病毒苗木生产许可证和无病毒苗木准产数量证明，并要对其使用的接穗，砧木的来源、数量，以及苗木类型、数量进行查核。 6.1.2 圃内检验：苹果无病毒苗木的病毒检测在无病毒苗木生长期间抽样进行。病毒检测方法见本标准第5章。 6.1.3 出圃检验：园艺性状的质量检验按GB 9847规定执行。发现GB 8370中规定的检疫对象时，按该规程处理。 6.2 抽样 6.2.1 苗木规格和检疫对象的检验，其抽样量分别按GB 9847和GB 837
9、0规定执行。 6.2.2 病毒检测抽样数量：繁殖材料来源于无病毒母本园的苗圃，每亩抽检10株，每增加1亩增加2株；直接从国外引进的无病毒种苗或砧木原种，每株都需检测，由此繁育的苗木，按前述办法抽样进行病毒检测。 6.3 判定规则 抽检不带前述6种苹果病毒、GB 8370中的检疫对象，苗木规格符合GB 9847指标要求的为合格，否则为不合格。 7 标志、包装、运输和保管 7.1 标志 7.1.1 苹果无病毒苗木合格证标签由苹果病毒检测管理机构监制和签发。 7.1.2 无病毒苗木合格证标签规格见GB 12943。 7.1.3 每株无病毒苗木都要挂上标签。 7.2 包装 7.2.1 无病毒苗木需按品
10、种和苗木种类（实生砧嫁接苗、矮砧嫁接苗、矮化中间砧苗、自根苗）分别包装。 7.2.2 包装内外都要挂牌标记，注明品种、苗木种类、数量及产地名称。 7.3 运输 运输与普通苗木相同。 7.4 保管 7.4.1 苹果无病毒苗木要与普通苗木隔离存放。 7.4.2 无病毒苗木要有专人负责保管，以防丢失和调换，并要有详细的进出记录，以备查对。 页码，4/6NY 32919972006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN329000A.htm附 录 A （标准的附录） A蛋白酶联免疫吸附法（PAS- ELISA） A1 包被A蛋白 用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释A蛋
11、白纯品，检测工作浓度为15 g/mL，每孔100200 L，28保温2h，然后甩干，用PBST洗板34次，每次静止35min。 A2 加第一抗血清 抗血清用PBST稀释，每孔加100200 L，28保温2h，冲洗（方法同上）。 A3 加抗原样品 取苹果嫩叶或一年生休眠枝条内皮层，加入5倍（ m/V）抗原提取液，磨碎后 4000r/min离心5min，取上清液，每孔加100200 L，每样品23孔，每个微孔板需同 时设阳性、阴性和空白对照。4冰箱过夜，冲洗（方法同上），第一次冲洗液不得溢出。 A4 加第二抗血清 抗血清用PBST稀释，每孔100200 L，保湿和冲洗方法同A1。 A5 加酶标A蛋
12、白 市售辣根过氧化物酶标A蛋白用PBST稀释至工作浓度，每孔100200 L，保湿和冲洗方法同A1。 A6 加底物 每孔100200 L，黑暗中室温放置1520min。 A7 中止反应 每孔加2550 L2mol/L硫酸。 A8 结果判断 以空白对照孔调“0”，测定反应液在492nm波长处吸光值，以待检样品平均吸光值/阴性对照平均吸光值2视为阳性。 附 录 B （标准的附录） 指示植物田间检测法 B1 在4月上旬，挑选前一年播种生长整齐一致的砧木实生苗，定植于苗圃中，每行50100株，株行距不小于15cm60cm。检测圃周围100m以内不得栽植梨树，50m以内不得栽植苹果树。 页码，5/6NY
13、 32919972006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN329000A.htmB2 8月中下旬从待检样本树或待检苗上剪取一年生枝条，作为待检接穗，并按待检树的品种树号编号写好标签，绑缚在待检接穗上。每一待检样本需有1520个饱满芽。 B3 从指示植物母本树上剪取当年生枝条，作为检测接穗，其饱满芽数量相当于待检接穗的45倍。 B4 上述材料准备就绪后，即可进行嫁接，嫁接采用二重芽接法，先把待检接穗的芽片嫁接在砧木基部，每株嫁接12个待检芽（如芽量不足用树皮亦可）。一株待检树上接穗在同一行砧木上嫁接45株，并按待检树的编号挂好标牌。 B5 削取指示植物的芽片嫁
14、接在前项待检芽的上方，两芽相距1.02.0cm，每一行砧木嫁接同一种指示植物。 B6 嫁接后，第二年苗木发芽前，在指示植物接芽的上方约1.01.5cm处剪除砧干。加强肥水管理，及时除萌锄草和防治病虫害，要特别注意食叶性害虫的防治，以免影响检测结果。 B7 从5月中下旬开始，每周定期观察指标植物的症状表现，作好观察记录，根据指标植物的症状反应，明确待检树是否还潜带病毒。 附 录 C （标准的附录） 指示植物温室检测法 C1 于3月下旬取上年播种的砧木种子实生苗，栽植于直径15cm，高25cm 的泥花盆中，作为鉴定用砧木。于8月中下旬，将待检树芽片芽接在砧苗基部。每一嫁接株按品种编号挂好标签，每一待检样本嫁接4盆。 C2 翌年2月上中旬，将花盆移入温室内，温室温度白天2025，夜间915，待砧苗开始萌发生长后，用芽接法在相应组合待检芽上方嫁接指示植物接穗。 C3 嫁接后的温室温度控制在1826，同时要注意防治害虫和控制萌蘖生长，待指示植物发芽长出嫩叶片后，每周观察一次，记载症状表现。 页码，6/6NY 32919972006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN329000A.htm
