1、ICS65.150CCS B 504505北海市地方标准DB4505/T 00102023岛礁石斑鱼生态增殖技术规范Technical specification for ecological enhancement ofreef-inhabiting groupers2023-03-08 发布2023-04-08 实施北海市市场监督管理局发 布DB4505/T 00102023I目次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14海域及容量选择.2海域自然条件.2增殖容量.25种类选择.26苗种繁育、规格及适应性驯化.2苗种繁育.2规格.2适应性驯化.27苗种检验检疫.3检验资质
2、机构要求.3抽检原则与数量要求.3检验内容与方法.38苗种原生性鉴定.3用于微卫星标记检测的样品采集.3样品采集、运输与保藏条件.3DNA 提取.3微卫星基因分型方法.3统计分析.4原生性判定.49生态增殖.4苗种类型.4增殖放流方法.4苗种比例及放流要求.410增殖效果评估.4基于标志石斑鱼的增殖效果评估.4基于环境 DNA 调查的增殖效果评估.5基于微卫星分子标记的增殖效果评估.511管理.5附录 A（规范性）石斑鱼生态增殖放流情况记录表.6附录 B（资料性）环境 DNA 的调查方法.7B.1抽样.7DB4505/T 00102023IIB.2运输.7B.3保藏.7B.4DNA 提取.7B
3、.5鱼类物种鉴定.7附录 C（资料性）基于微卫星分子标记的石斑鱼增殖放流群体回捕占比率计算.10C.1样本采集.10C.2样本保存.10C.3样本 DNA 提取.10C.4微卫星基因分型.10C.5石斑鱼回捕抽样样本的遗传区分.10C.6石斑鱼增殖放流群体回捕占比率计算.10参考文献.11DB4505/T 00102023III前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由北海市海洋局提出并归口。本文件起草单位：中国科学院南海海洋研究所、中山大学、广东海洋大学
4、、海南大学、广西科学院、广西精工海洋科技有限公司、湛江市东海岛东方实业有限公司。本文件主要起草人：胡超群、王学锋、李广丽、夏军红、周永灿、陈廷、吴小易、李文笙、孙彩云、陈偿、罗鹏、柯志新、田昌绪、李建龙、姜发军、宋建强、陈文林。DB4505/T 001020231岛礁石斑鱼生态增殖技术规范1范围本文件规定了岛礁石斑鱼生态增殖的海域选择、种类选择、苗种繁育、适应性驯化、检验检疫及增殖容量要求，描述了苗种原生性鉴定、生态增殖及增殖效果的监测和评估方法，提供了石斑鱼生态增殖管理的指导意见。本文件适用于北海市辖区内岛礁石斑鱼的生态增殖。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必
5、不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 11607.3渔业水质标准第3部分：渔业水质要求GB/T 18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法GB/T 20361水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB 31656.13食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱-串联质谱法GB/T 34748.7水产种质资源基因组DNA的微卫星分析第7部分：分析步骤NY 5070无公害食品水产品中渔药残留限量SC/T 3018水产品中氯霉素残留量的测定气相色谱法SC/
6、T 9401.4水生生物增殖放流技术规程第4部分：水域条件SC/T 9401.6水生生物增殖放流技术规程第6部分：放流物种质量农业部公告第1125号一、二、三类动物疫病病种目录（水生动物部分）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。原生种original species在无人为干预的野生环境下自然演化而来的物种。生态增殖ecological enhancement采用放流、移植或栽培、底播等人工方式，在生态系统承载力范围内，利用天然生产力增加生物种群产量的过程。适应性驯化adaptive domestication增殖放流苗种适应野外海域环境的人工处理过程。DB4505/T 001020232
7、原位增殖in-situ stock enhancement在放流物种原本栖息的生境中，通过生态增殖手段，利用天然生产力增加放流种群产量的过程。环境 DNAenvironmental DNA从环境样本中提取的所有DNA的集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA。4海域及容量选择海域自然条件应符合SC/T 9401.4的规定，且满足下列条件：a)岛礁为岩礁或人工鱼礁，水流较缓且附近底质起伏而又多石砾；b)溶解氧5 mg/L，盐度 2235，水温 22 33。增殖容量增殖容量不超过拟增殖海域历史上最大捕捞产量的2倍。5种类选择选择生活史大部分
8、时间主要栖息于珊瑚礁、岩礁或人工鱼礁且活动范围较小的石斑鱼原生种。禁止采用外来种、杂交种、转基因种以及其他不符合生态要求的石斑鱼物种进行生态增殖。适合生态增殖的石斑鱼种类主要有斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、棕点石斑鱼（E.fuscoguttatus）和豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）。6苗种繁育、规格及适应性驯化苗种繁育人工繁育的苗种在培育过程中，水质应符合GB 11607.3规定的要求，病害检测按照SC/T 9401.6规定的方法进行，培育期间应做好培育过程的采样分析和观测数据记录，主要包括海水理化因子（水温、溶解氧、pH、盐度、氨氮和有机
9、质等）、投喂的饲料类型（或活饵种类）、饲料粒径（饲料号数）、苗种数量、鱼苗活力及体形外观等。规格增殖放流的石斑鱼全长宜在5 cm以上。适应性驯化宜满足以下内容：a)苗种放流前 14 d28 d 宜模拟增殖海域的水温、盐度等环境条件对苗种进行驯化；b)在有条件的情况下开展行为驯化，不限于捕食和躲避敌害生物等行为驯化，以增强放流苗种的野外适应能力；DB4505/T 001020233c)有条件的情况下对石斑鱼苗种进行音响驯化，并在放流海域继续进行音响驯化，以提高增殖效果。7苗种检验检疫检验资质机构要求由具备相应检验资质的单位进行检验，并出具正式报告。抽检原则与数量要求随机取样，常规质量检验每次取样
10、尾数不少于50尾。检验内容与方法苗种质量的检验内容、检验方法与要求见表1。表1苗种质量的检验内容、方法与要求检验内容检验方法与要求感官质量规格整齐、活力强，外观完整，体表光洁可数指标规格合格率90以上，死亡个体比例、伤残率、畸形率之和5病害参照SC/T 9401.6方法检测，无病害,不得检出农业部公告第1125号规定的水生动物疫病病种药残分别参照GB/T 20361、SC/T 3018、GB 31656.13方法检测孔雀石绿、氯霉素和硝基呋喃类代谢物。符合NY 5070的要求，不得检出药残其它对于苗种的特发病、易发病及新型药残，依照最新标准所规定的方法进行检测。检测结果达到无公害食品类标准8苗
11、种原生性鉴定用于微卫星标记检测的样品采集8.1.1原生种：在放流物种分布的海域内随机抽样，数量为 50 尾60 尾。8.1.2待检苗种群体：随机抽样，每批次取样 50 尾60 尾。样品采集、运输与保藏条件现场取1 cm1 cm的尾鳍样品，保存于盛有5 mL无水乙醇的10 mL离心管中，常温运回实验室后，将10 mL离心管中的无水乙醇更换一次，放入-80 或-20 低温冰箱长期保存。DNA 提取按常规酚-氯仿法提取总DNA，放入-80 或-20 低温冰箱长期保存。微卫星基因分型方法按照GB/T 34748.7规定的方法进行。DB4505/T 001020234统计分析利用微卫星分子标记分析软件G
12、eneMapper和Cervus进行遗传多样性和基因流分析。原生性判定当待检苗种群体与原生种群体间不存在显著遗传差异（P0.05），可判定待检苗种群体与本地群体存在明显基因交流，属于同一种群来源。9生态增殖苗种类型9.1.1未标志石斑鱼苗种未进行过任何标志处理的石斑鱼苗种。9.1.2标志石斑鱼苗种采用挂牌、金属线码、被动式整合雷达标志、超声波标志或无线电标志等方法进行标志处理的石斑鱼苗种。增殖放流方法9.2.1原位增殖根据岛礁自然礁体结构和生物资源、生态环境现状以及拟增殖石斑鱼种类的栖息习性等基础数据，直接将规模化培育的大规格苗种在石斑鱼原生种的栖息生境进行增殖。9.2.2定点增殖将石斑鱼苗种
13、运送到适宜石斑鱼栖息的预设站位放流，进行增殖。苗种比例及放流要求标志石斑鱼占石斑鱼总放流量的比例宜为510。标志石斑鱼群体与未标志群体应在同一海域、同一站点和同一时间进行放流。标志与未标志石斑鱼的数量比在每一个放流站点应尽量保持一致。对石斑鱼的增殖放流情况应做好记录（见附录A）。10增殖效果评估基于标志石斑鱼的增殖效果评估10.1.1放流一年后在放流海域进行监测性回捕。从每个增殖放流石斑鱼种类回捕样本中各随机抽取50 尾60 尾，分别统计每种石斑鱼抽样样本中标志石斑鱼的个体数，基于标志石斑鱼个体数计算石斑鱼回捕占比率，见公式（1）：=()100(1)式中：RMH石斑鱼增殖放流群体回捕占比率，用
14、表示；a石斑鱼增殖放流种类个数；DB4505/T 001020235Ni第i种类石斑鱼回捕抽样样本中标志石斑鱼的个体数，单位为尾；Pi第i种类标志石斑鱼在该种类放流石斑鱼中的占比，用表示；Ti第i种类石斑鱼回捕抽样样本的总个体数，单位为尾。10.1.2按照表 2 的分级标准，进行石斑鱼生态增殖效果的分级评估。表2基于标志石斑鱼的生态增殖效果评估分级指标增殖效果评估分级优良一般差RMH2010,20)5,10)5基于环境 DNA 调查的增殖效果评估按照附录B的方法对放流海域的环境DNA进行调查和分析，鉴定放流海域存在的石斑鱼种类和相对丰度，进而评估石斑鱼的增殖效果。基于微卫星分子标记的增殖效果评
15、估10.3.1石斑鱼增殖放流实施一年后，在放流海域进行石斑鱼群体回捕，并基于微卫星分子标记技术进行石斑鱼增殖放流群体回捕占比率的计算。石斑鱼增殖放流群体回捕占比率(RH)的计算方法见附录 C。10.3.2按照表 3 的分级标准，进行石斑鱼生态增殖效果的分级评估。表3基于微卫星分子标记的石斑鱼生态增殖效果评估分级指标增殖效果评估分级优良一般差RH2010,20)5,10)511管理石斑鱼增殖放流后，应定期巡查增殖放流海域。采用水下视频监测或潜水的方式，观察增殖放流石斑鱼的活动和生长情况，为进一步优化石斑鱼生态增殖技术提供依据。DB4505/T 001020236附录A（规范性）石斑鱼生态增殖放流
16、情况记录表石斑鱼生态增殖放流情况记录表见表A.1。表A.1 石斑鱼生态增殖放流情况记录表增殖放流单位：记录日期：石斑鱼种类盐度pH水温（）放流数量（尾）标志放流数量（尾）放流规格标志放流规格放流人员放流海域边缘坐标 1放流海域边缘坐标 2放流海域边缘坐标 3放流海域边缘坐标 4放流海域边缘坐标 5放流海域边缘坐标 6放流海域边缘坐标 7放流海域边缘坐标 8放流海域边缘坐标 9放流海域边缘坐标 10放流海域边缘坐标 11放流海域边缘坐标 12记录人：核对人：DB4505/T 001020237附录B（资料性）环境 DNA 的调查方法B.1抽样按照GB/T 18654.2规定的抽样方法执行。每个区
17、域至少设置3个取样点，在每个取样点贴近海底沉积物处取1 L海水，重复取样3次，1 L去离子水作为对照。B.2运输样品在运输过程中，辅以干冰或冰块，将容器内的温度控制在25 以下。B.3保藏样品运送至实验室后，采用孔径为0.22 m的醋酸纤维素过滤膜进行过滤。过滤后的滤纸装进试管，保存于-80，直至DNA抽提。B.4DNA 提取按照常规酚-氯仿法提取总DNA。DNA放入-80 或-20 低温冰箱长期保存。B.5鱼类物种鉴定B.5.1用于鱼类鉴定的条形码用于鱼类属、种鉴定的条形码为12S rRNA基因，片段长度为163 bp185 bp。B.5.2PCR引物B.5.2.1第 1 轮 PCR 扩增鱼
18、类通用引物序列MiFish-U-F：5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3MiFish-U-R：5-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3在上述两条引物中，前面的33个和34个核苷酸（nt）部分为高通量测序引物的结合位点，随后的6个随机引物（NNNNNN，如AAGGTT）用于促进测序平台流动池（flowcell）DNA簇的分离，最后的21个和25个碱基序列为12S rRNA基因通用引物序列。B.5.2.2第
19、 2 轮扩增通用引物Forward：5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3Reverse：5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3在上述两条引物中，8个连续X碱基代表Illumila测序技术通用的Index序列，可以用于区分不同样本；连续X碱基前面的5端序列允许扩增产物与测序平台流动池（flowcell）的寡核苷酸进行特异结合，连续X碱基后面的3端序列是Illumila测序引物结合位点，该
20、引物组合为Illumila测序建库专用引物。DB4505/T 001020238B.5.3PCR扩增B.5.3.1第一轮 PCR 扩增PCR反应在热循环仪器（如Model 9700）中进行，PCR体系的反应体积为12 L，其中包括4.6 L双蒸水、6 L 2HiFi HotStart ReadyMix、0.2 L正向引物（10 M）、0.2 L反向引物（10 M）和1.0 L总DNA模板（50 ng/L）。PCR热循环条件：95 高温预变性3 min；95 变性20 s，65 退火15 s，72 延伸15 s，共30个循环；72 再延伸5 min。B.5.3.2第二轮 PCR 扩增将第一轮PC
21、R产物稀释10倍作为第二轮PCR模板，PCR体系的反应体积为12 L，包括6.0 L 2HiFiHotStart ReadyMix、0.7 L正向引物（5 M）、0.7 L反向引物（5 M）、3.6 L双蒸水和1.0 L模板。PCR热循环条件：95 预变性3 min；98 变性20 s，65 退火15 s，72 延伸15 s；72 再延伸5 min。B.5.4PCR产物检测利用1.5琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。取5 LPCR产物，上样后在120 V恒压下电泳25 min。采用DNA凝胶成像系统观察扩增情况,目标基因序列约为370 bp。B.5.5测序切胶纯化PCR产物，送测序服务公司进行Il
22、lumila高通量测序。B.5.6石斑鱼属、种鉴定B.5.6.1序列聚类采用生物信息学软件FastQC、Cutadapt和USEARCH，对原始测序数据质量进行分析并去除低质量数据。采用QIIME2分析软件，在97的序列相似水平下，对高质量的eDNA测序序列数据进行聚类，去除冗余序列，获得所有序列的分类单元（OTU）。B.5.6.2物种注释通过序列比对方法，将所有的分类单元数据与已知物种的核糖体RNA序列数据库进行序列比对，从而获得每个分类单元的物种注释数据。B.5.6.3分类鉴定基于物种注释数据，鉴定eDNA样本中的石斑鱼属和种。B.5.7特定石斑鱼属、种的相对丰度计算B.5.7.1特定石斑
23、鱼属的相对丰度为特定石斑鱼属序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算见公式（A.1）：=()100(A.1)式中：Rg 特定石斑鱼属相对丰度，用表示；Gn特定石斑鱼属的序列条数，单位为条；Tn全部鱼类序列条数，单位为条。DB4505/T 001020239B.5.7.2特定石斑鱼种的相对丰度为特定石斑鱼种序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算见公式（A.2）：=()100(A.2)式中：Rs 特定石斑鱼种相对丰度，用表示；Sn特定石斑鱼种的序列条数，单位为条；Tn全部鱼类序列条数，单位为条。DB4505/T 0010202310附录C（资料性）基于微卫星分子标记的石斑鱼增殖放流群体回捕占比率
24、计算C.1样本采集对于用于增殖放流的不同种类石斑鱼，增殖放流前分别采集原生种群和增殖放流苗种群体样本各50尾60尾，回捕时分别从每种石斑鱼的回捕样本中随机抽取50尾60尾。C.2样本保存样本采集后，用剪刀剪取1 cm1 cm的尾鳍样品，置于含有5 mL 95乙醇的10 mL离心管中，辅以干冰或冰块，将样本常温运至实验室保存。C.3样本 DNA 提取采用常规的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取石斑鱼样本DNA，DNA浓度50 ng/L，OD260/OD280=1.82.0。C.4微卫星基因分型分别筛选各增殖放流石斑鱼种类的高度多态性微卫星分子标记用于遗传多样性分析。按照GB/T 34748.
25、7规定的方法进行分析，对所有增殖放流种类的石斑鱼样本进行基因分型。C.5石斑鱼回捕抽样样本的遗传区分利用本文件C.4的分型结果，通过GenAIEx 6.51b2和MEGA 6.0软件分别对每种石斑鱼的3个群体（原生种群、增殖放流苗种和回捕样本）进行遗传分析，鉴定每种石斑鱼的回捕抽样样本与同种类增殖放流苗种群体和原生种群间的遗传距离，如某一种类石斑鱼回捕抽样样本与该种类增殖放流苗种群体具有相似的分子遗传特征，且聚为一类时，可确定其为该种类增殖放流群体的回捕个体。C.6石斑鱼增殖放流群体回捕占比率计算统计每种石斑鱼回捕抽样样本中增殖放流群体的回捕个体数，计算石斑鱼增殖放流群体回捕占比率的方法见公式
26、（C.1）：=100(C.1)式中：RH石斑鱼增殖放流群体回捕占比率，用表示；b 增殖放流石斑鱼的种类个数；Hi第i种类增殖放流石斑鱼回捕抽样样本中增殖放流群体的回捕个体数，单位为尾；Ci 第i种类增殖放流石斑鱼回捕抽样样本的总个体数，单位为尾。DB4505/T 0010202311参考文献1M.Miya,Y.Sato,T.Fukunaga,T.Sado,J.Y.Poulsen,K.Sato,T.Minamoto,S.Yamamoto,H.Yamanaka,H.Araki,M.Kondoh,and W.Iwasaki.MiFish,a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes:detection of more than 230 subtropical marine species.R.Soc.open sci,2015,2(7):150088.
