1、ICS65.150CCS B 504505北海市地方标准DB4505/T 00082023岛礁贝类生态增殖技术规范Technical specification for ecological enhancement ofreef-inhabiting shellfish2023-03-08 发布2023-04-08 实施北海市市场监督管理局发 布DB4505/T 00082023I目次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14海域选择.2自然条件.2海水理化条件.25物种选择.26种苗培育及苗种要求.27苗种检验检疫.2检验资质机构要求.2抽检原则与数量要求.3检验内容与方法
2、.38生态增殖.3苗种的适应性驯化及优选.3苗种运输方法.3底播增殖.49增殖容量.410贝类丰度监测.4潜水员和设备.4潜水断面设置.4丰度监测与计算.411效果评估.4基于贝类丰度的增殖效果评估.4基于环境 DNA 的增殖效果评估.5基于增殖群体回捕占比率的增殖效果评估.512管理.6附录 A（规范性）贝类生态增殖放流情况记录表.7附录 B（资料性）基于环境 DNA 的贝类丰度计算.8B.1特异性 qPCR 扩增引物设计.8B.2PCR 扩增、质粒构建及质粒标准模板制备.8B.3DNA 标准定量曲线制作.8B.4环境 DNA 的 qPCR 扩增及贝类丰度计算.8附录 C（资料性）基于微卫星
3、分子标记的贝类增殖群体回捕占比率计算.10DB4505/T 00082023IIC.1样本采集.10C.2样本保存.10C.3样本 DNA 提取.10C.4多态性 SSR 位点的筛选.10C.5PCR 扩增及基因分型.10C.6贝类回捕抽样样本的遗传区分及回捕占比率计算.10DB4505/T 00082023III前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由北海市海洋局提出并归口。本文件起草单位：中国科学院南海海洋研究所、海南大学、广西科学院、广西精工海洋科
4、技有限公司、湛江市东海岛东方实业有限公司。本文件主要起草人：胡超群、黄勃、张跃环、刘文广、陈偿、罗鹏、李军、马海涛、秦艳平、陈袳、张华、王小兵、姜发军、柯志新、宋建强、陈文林。DB4505/T 000820231岛礁贝类生态增殖技术规范1范围本文件规定了岛礁贝类生态增殖的海域选择、物种选择、种苗培育、苗种检验检疫及增殖容量要求，描述了生态增殖效果监测与评估的方法，提供了贝类生态增殖管理的指导意见。本文件适用于北海市辖区内岛礁贝类的生态增殖。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，
5、其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 11607渔业水质标准GB/T 12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查SC/T 2106牡蛎人工繁育技术规范SC/T 2108鲍人工繁育技术规范SC/T 9401.6水生生物增殖放流技术规程第6部分：放流物种质量SC/T 9401.11水生生物增殖放流技术规程第11部分：投放农业部公告第1125号一、二、三类动物疫病病种目录（水生动物部分）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。原生种original species在无人为干预的野生环境下自然演化而来的物种。生态增殖ecological enhancement采用放流、移植或栽培、底
6、播等人工方式，在生态系统承载力范围内，利用天然生产力增加生物种群产量的过程。适应性驯化adaptive domestication增殖放流苗种适应野外海域环境的人工处理过程。底播增殖bottom sowing for stock enhancement通过播撒底栖生物苗种到适合的海底生境中，利用天然生产力增加放流种群产量的过程。环境 DNAenvironmental DNA从环境样本中提取的所有DNA的集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA。DB4505/T 0008202324海域选择自然条件根据岛礁环境特点，结合历史资料、捕捞生产
7、信息以及资源生态环境的本底调查资料，针对不同种类的贝类，筛选确定贝类生态增殖的海域。增殖海域应生态环境良好、饵料生物丰富、水流畅通。海水理化条件增殖海域的海水理化因子应符合表1的要求。表1增殖海域海水理化因子要求海水理化因子参数水温18 35 盐度2535pH8.08.5底层溶解氧5.0 mg/L其它水质因子符合GB 11607的规定5物种选择选择目标海区或周边海区的礁栖贝类原生种，禁止采用外来种、杂交种、转基因种以及其他不符合生态要求的贝类物种进行生态增殖。适宜生态增殖的礁栖贝类种类主要为大珠母贝（Pinctada maxima）、马氏珠母贝（P.fucata）、珠母贝（P.margarit
8、ifera）、企鹅珍珠贝（Pteria penguin）、杂色鲍（Haliotis diversicolor）、塔形马蹄螺（Trochus pyramis）和福建牡蛎（Crassostrea angulata）。6种苗培育及苗种要求参照 SC/T 2108 规定的方法进行鲍类种苗培育，参照 SC/T 2106 规定的方法进行牡蛎和螺类的种苗培育。用于生态增殖的贝苗应活力强、外观无损伤、无畸形、规格整齐。规格应符合表 2 的要求。表2生态增殖贝类苗种规格规格等级体长cm小规格0.5,1）中规格1,1.5）大规格1.5,2）7苗种检验检疫检验资质机构要求由具备相应检验资质的单位进行检验，并出具正式
9、报告。DB4505/T 000820233抽检原则与数量要求随机取样，常规质量检验每次取样不少于50个。检验内容与方法苗种质量的检验内容、检验方法与要求见表1。表3苗种质量的检验内容、检验方法与要求检验内容检验方法与要求感官质量规格整齐、外观完整可数指标规格合格率90以上，死亡个体比例、伤残率、畸形率之和5病害参照SC/T 9401.6方法检测，无病害,不得检出农业部公告第1125号规定的水生动物疫病病种8生态增殖苗种的适应性驯化及优选8.1.1苗种的适应性驯化贝类苗种的适应性驯化方法如下：a)在室内人工养殖环境下，从稚贝开始，根据贝类的种类，投喂天然藻类饵料，对贝类进行适应性驯化；b)投放贝
10、类小规格苗种 10000 个或中规格苗种 4000 个或大规格苗种 2000 个，每 10 m2投放与贝类苗种等规格的蟹 5 只，在底播生态增殖前对贝类苗种进行为期 7 d 的躲避天敌能力的适应性驯化；c)第 8 d 不投喂饲料，只进行大量换水，并进行吸底，以去除贝苗的排泄物。8.1.2驯化苗种优选在驯化的贝类苗种中挑选健壮、活力好的个体，进行运输和底播生态增殖。苗种运输方法包括适合长途运输的水运法或适合短途运输的充气干运法。8.2.1水运法一般采用水车，在车内用空调将温度控制在 20 30，车内配备充气装置及降温设备，运输时间宜控制在 48 h 以内，运输时间大于 48 h 时，需就地暂养后
11、再进行运输。8.2.2干运法8.2.2.1充气干运法：适合短途运输。将贝类苗种放入双层塑料袋内，密度控制在小规格贝苗 150 个/L 或中规格贝苗 100 个/L 或大规格贝苗 50 个/L，注入纯氧后，将塑料袋放入泡沫箱内，密封。将泡沫箱放入转运框中，盖上顶盖以防贝类逃逸。运输时间宜控制在 10 h 以内。8.2.2.2非充气干运法：适合部分牡蛎苗种的短途运输。此方法一般用湿毛巾覆盖在苗种上，保持苗种及附着体湿润即可。DB4505/T 000820234底播增殖8.3.1底播时间贝类苗种宜在每年的312月进行底播。8.3.2底播天气选择晴朗、多云或阴天进行贝类底播生态增殖，海面最大风力5级，
12、气温35。8.3.3苗种运输采用本文件 8.2 中的方法将贝类苗种运输至底播预定海域。8.3.4苗种底播船速：2 m/s4 m/s，投放密度：0.1个/m20.2个/m2，苗种底播按照SC/T 9401.11中的方法进行，记录投放中心位点的经纬度、投放数量和覆盖范围，填写贝类增殖放流情况记录表（见附录A）。9增殖容量不超过增殖海域历史上礁栖贝类最大捕捞产量的2倍。10贝类丰度监测潜水员和设备按GB/T 12763.6的规定进行潜水员配备和设备准备。潜水断面设置在生态增殖海域每平方公里设置1个监测断面，断面应均匀分布于增殖海域，每个断面宽1.2 m，直线距离50 m，断面设置方法为：在监测海域内
13、，通过潜水设定起点，沿礁石走向拉皮尺至终点，起点到终点总距离为50 m。丰度监测与计算潜水员沿皮尺方向进行断面内贝类调查，观察到的贝类个体均计入贝类数量，并根据贝类形态辨别贝类种类，进行断面内贝类数量统计。调查海域的贝类丰度计算见公式（1）：=(1.2 50 )10000(1)式中：As调查海域的贝类丰度，单位为个/hm2；n 断面个数；Si 第i个断面内观察到的贝类数量，单位为个。11效果评估基于贝类丰度的增殖效果评估11.1.1生态增殖实施一年后，潜水调查贝类丰度，基于贝类丰度的生态增殖效果评估值（RQ）计算见DB4505/T 000820235公式（2）：=/100(2)式中：RQ 生态
14、增殖效果评估值，用表示；AQ2实施一年后生态增殖海域的贝类丰度，单位为个/hm2；AQ1生态增殖海域的本底贝类丰度，单位为个/hm2。11.1.2按照表 4 的分级标准，进行贝类生态增殖效果的分级评估。表4基于贝类丰度的生态增殖效果评估分级指标增殖效果评估分级优良一般差RQ2010,20)5,10)5基于环境 DNA 的增殖效果评估11.2.1生态增殖实施一年后，调查增殖海域底层海水中的生态增殖种类贝类 DNA 丰度（方法见附录B），基于环境 DNA 的贝类生态增殖效果评估值（RE）计算见公式（3）：=()/100(3)式中：RE 生态增殖效果评估值，用表示；AE2实施一年后生态增殖海域底层海
15、水中的生态增殖种类贝类DNA丰度，单位为拷贝/mL；AE1生态增殖海域底层海水中的生态增殖种类本底贝类DNA丰度，单位为拷贝/mL。11.2.2按照表 5 的分级标准，进行贝类生态增殖效果的分级评估。表5基于环境 DNA 的贝类生态增殖效果评估分级指标增殖效果评估分级优良一般差RE2010,20)5,10)5基于增殖群体回捕占比率的增殖效果评估11.3.1贝类底播增殖实施一年后，在增殖海域进行贝类增殖群体回捕，按照基于微卫星分子标记的贝类增殖群体回捕占比率的计算方法（见附录 C）计算增殖群体回捕占比率(RH)。11.3.2按照表 6 的分级标准，进行贝类生态增殖效果的分级评估。表6基于增殖群体
16、回捕占比率的贝类生态增殖效果评估分级指标增殖效果评估分级优良一般差RH2010,20)5,10)5DB4505/T 00082023612管理贝类增殖放流后，应定期巡查放流海域，防止非法捕捞生态增殖海域的贝类资源。DB4505/T 000820237附录A（规范性）贝类生态增殖放流情况记录表贝类生态增殖放流情况记录表见表A.1。表A.1 贝类生态增殖放流情况记录表增殖放流单位：记录日期：贝类种类pH盐度水温（）放流数量（个）规格放流人员放流海域边缘坐标 1放流海域边缘坐标 2放流海域边缘坐标 3放流海域边缘坐标 4放流海域边缘坐标 5放流海域边缘坐标 6放流海域边缘坐标 7放流海域边缘坐标 8
17、放流海域边缘坐标 9放流海域边缘坐标 10放流海域边缘坐标 11放流海域边缘坐标 12记录人：核对人：DB4505/T 000820238附录B（资料性）基于环境 DNA 的贝类丰度计算B.1特异性 qPCR 扩增引物设计分别针对所有用于生态增殖的贝类种类的线粒体COI基因或基因组DNA特异区域设计种特异性qPCR扩增引物，引物设计的原则为：引物特异性强，长度19 bp22 bp，GC含量4060，碱基分布均匀，扩增片段长度为150 bp200 bp。B.2PCR 扩增、质粒构建及质粒标准模板制备分别以每种贝类的DNA为模板，进行特异性PCR扩增。纯化PCR扩增产物后，采用常规的方法进行PCR
18、产物克隆与质粒转化，提取质粒，溶于50 L ddH2O中，-20 保存，测量每种贝类质粒的浓度。质粒浓度计算见公式（B.1）：=6.02 10 (660 )10(B.1)式中：ST质粒浓度，单位为拷贝/L；6.021023阿伏伽德罗常数，单位为拷贝/mol；CON质粒检测浓度，单位为g/L；660碱基对平均分子量，单位为g/mol/bp；NT质粒碱基数量，单位为bp。B.3DNA 标准定量曲线制作将每种贝类的质粒分别稀释至101 拷贝/L、102 拷贝/L、103 拷贝/L、104 拷贝/L、105 拷贝/L、106 拷贝/L、107 拷贝/L和108 拷贝/L，作为标准模板，对于每种贝类，取
19、1 L各浓度的质粒模板，利用本文件B.1设计的特异性引物进行qPCR扩增，以测得的扩增循环数(Ct值)为纵坐标，以质粒浓度的对数为横坐标，分别绘制每种贝类的DNA标准定量曲线。B.4环境 DNA 的 qPCR 扩增及贝类丰度计算B.4.1环境DNA提取使用标准采水器收集贝类生态增殖海域的底层海水，每个点采集500 mL海水样品，使用0.22 m滤膜对底层海水进行过滤，剪碎滤膜，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒对滤膜上的生物样本进行DNA提取，提取后的DNA溶于50 L ddH2O中，-20 保存，作为环境DNA。B.4.2环境DNA的qPCR扩增及增殖种类贝类DNA的定量以1 L上述提取
20、的环境DNA为模板，利用本文件B.1设计的各种贝类的特异性引物分别进行qPCR扩增，扩增体系为20 L，测量样品Ct值，通过标准曲线，求得Ct值所对应的模板中各种贝类DNA的丰度。DB4505/T 000820239B.4.3基于环境DNA的贝类丰度计算在调查海域至少设置采样点6个，采集采样点海域的底层海水500 mL，提取环境DNA，并按照本文件B.4.2的方法对样品中生态增殖种类贝类的DNA进行定量，底层海水中生态增殖种类贝类DNA丰度的计算见公式（B.2）：=(B.2)式中：AE 调查海域底层海水中生态增殖种类贝类DNA丰度，单位为拷贝/mL；m 调查海域采样点个数；a生态增殖的贝类种类
21、个数；AEij调查海域第i个采样点底层海水中第j种生态增殖种类贝类DNA丰度，单位为拷贝/mL。DB4505/T 0008202310附录C（资料性）基于微卫星分子标记的贝类增殖群体回捕占比率计算C.1样本采集对于用于生态增殖的不同种类贝类，增殖前分别采集原生种群和增殖苗种群体样本各50个60个，回捕时分别从每种贝类的回捕样本中随机抽取50个60个。C.2样本保存样本采集后，用剪刀剪取一块200 mg500 mg的贝类体壁组织，置于10 mL离心管中，加入5 mL 95乙醇，常温运至实验室保存。C.3样本 DNA 提取采用常规的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取贝类样本DNA，DNA浓度5
22、0 ng/L，OD260/OD280=1.82.0。C.4多态性 SSR 位点的筛选对于每个用于生态增殖的贝类种类，分别筛选具有种特异性的高度多态性SSR标记。筛选方法为：采集不同地理分布的各种贝类群体，进行基因组测序并利用MISA软件分别查找具有地理差异的各种贝类的SSR位点，采用Primer Premier 5软件设计引物，对具有地理差异的各种贝类的基因组DNA分别进行PCR扩增，采用遗传分析仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper3.2软件读取等位基因片段的长度，采用Cervus软件计算期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）及多态性信息含量（PIC），从每种贝类基因组中分别
23、筛选出20个30个具有高度多态性的SSR标记。C.5PCR 扩增及基因分型利用筛选到的贝类种特异性高度多态性SSR标记的特异性引物，分别对每种贝类样本进行PCR扩增。PCR反应体系25 L，包括：10PCR buffer 2.5 L、10 mM dNTP 0.5 L、高保真PCR酶1 U、正向引物（10M）0.5 L、反向引物（10 M）0.5 L、DNA模板1 L，其余由无菌双蒸水补足至25 L。PCR扩增程序为：95 预变性5 min；95 变性30 s，52 58 退火30 s，72 延伸30 s，共32个循环；72 再延伸6 min。采用遗传分析仪对PCR扩增产物进行分型，获得所有贝类
24、样本的基因型。C.6贝类回捕抽样样本的遗传区分及回捕占比率计算C.6.1贝类回捕抽样样本的遗传区分利用本文件C.5的分型结果，通过GenAIEx 6.51b2和MEGA 6.0软件分别对每种贝类的3个群体（原生种群、增殖苗种和回捕样本）进行遗传分析，鉴定每种贝类的回捕抽样样本与同种类增殖苗种群体和原生种群间的遗传距离，如某一种类贝类回捕抽样样本与该种类增殖苗种群体具有相似的分子遗传特征，且聚为一类时，可确定其为该种类增殖群体的回捕个体。C.6.2贝类增殖群体回捕占比率计算统计每种贝类回捕抽样样本中增殖群体的回捕个体数，计算贝类增殖群体回捕占比率的方法见公式（C.1）：DB4505/T 0008202311=100(C.1)式中：RH贝类增殖群体回捕占比率，用表示；b 生态增殖贝类的种类个数；Hi第i种类生态增殖贝类回捕抽样样本中增殖群体的回捕个体数，单位为个；Ci 第i种类生态增殖贝类回捕抽样样本的总个体数，单位为个。
