1、UDC 633.1 :543.062 GB 中华人民共和国国家标准-GB-.4雪0-1一雪4叫忏9，-(.1忡谷类籽粒赖氨酸测定法染料结合赖氨酸(DBL)法Method for determination of Iysine in cereal grains 一Dye- binding Iysine method 1984-12-20发布1985一10 -01实施回来标准属批准中华人民共和国国家标准谷类籽粒赖氨酸测定法满斗结合赖氨酸(DBL)法Method for determination of Iysine in cereal grains -Dye - binding Iysine me
2、thod 本标准适用于测定水稻、玉米、高梁、麦类等谷类籽粒的赖氨酸含量。1 原理UDC 633.1: 543 .062 GB4801-84 在pH2左右缓冲体系中，样品蛋白质的碱性氨基酸(赖氨酸、组氨酸、精氨酸)可与偶氮璜酸染料酸性橙12等摩尔结合，生成不溶性络合物，其染料结合量(摩尔数相当于此三种碱性氨基酸的总和。若另取一份样品，先用丙酸即将蛋白质中赖氨酸的e-氨基掩蔽(丙散化作用)，使之失去与染料结合的能力，然后再与染料反应，所得染料结合量只是组氨酸和精氨酸之和。根据两次染料结合量的差值，便可算出该样品中的赖氨酸含量。2 仪器、设备2.1 分析天平:感量0.4mg。2.2 实验室用粉碎机。
3、2.3 GXD一201型蛋白质分析仪或GXDL-202型蛋白质赖氨酸分析仪主机。2.4 实验室用电动往复振荡机。2.5离心机:30-4000r jmin。2.6 30-35ml具塞玻璃管或聚乙烯管。2.7定量加液器或移液管:20、2、0.2ml。2.8 容量瓶:1000、100ml。S 试剂试剂除注明者外均为分析纯。3.1 草酸-乙酸-磷酸盐缓冲溶液:3.4g磷酸二氢挥和20g草酸(H2C204.2H:飞0)别溶于热水后，全部转移到1000ml容量瓶中。再加人1.7m185%磷酸，60ml冰乙酸，1 ml内酸，冷却至室温，用蒸锢水定容。3.2 3.89mM酸性橙12(Aoid 0 range
4、12，缩写成AO-12，分子式为C16Hll04 N2S N a，生化说:剂，层析纯，含量不少于90%)染料溶液，准确柑lIl1.363 g酸性橙12(纯度按100%计)，溶解于热的缓冲溶液后，再定量转移到1000ml容量瓶中，冷却至室温，用缓冲溶液定容。3.3 16%和8% (W jV)乙酸铀榕液z称取16.0g和8.0g乙酸铀(按无水乙酸铀计)，配成100ml溶被。3.4 丙酸自干:化学纯。4 标准曲线的绘制配制1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80mM酸性橙12染料标准系列溶液，在GXD一国家标准局1984-12一20发布1985-10一01实施GB 480
5、1-84 201型蛋白质分析仪上测定透光率(为提高灵敏度，用连续档测定。即以40ml3.89 mM染料溶液加|25ml缓冲榕液，调透光率为0，40m13.89 mM染料溶液加125ml缓冲溶液，调透光率为87)。然后以透光来(%)为纵电标，染料浓度(mM)为横坐标，在半对数座标纸上绘制标准曲线。或将透光率换算均吸光度，计算回归方轩。若用GXDL-202型蛋白质赖氨酸分析仪，则可直接读出吸光度，然后以吸光度E均纵电标，染料浓度(mM)为横坐标，在普通坐标纸上绘制标准曲线，或计算回归方担。5 测定步骤5. 1 试样的边取与制备i在取有代表性，谷类籽粒，挑拣于净，按四分法缩减取样，取样量不得少于20
6、g。将籽粒充分风卡或放在55-60cC烘箱中燥六小时以上。带壳水稻、高梁，先脱壳，再用粉碎机粉碎，使90%以上通过O.25mm筛孔，充分混匀，装人磨口瓶中备用。5.2 称样参照在1称样量，付J在酌化和不国先化样品各两份，准确到0.4mg，分别放人30-35ml具塞玻璃管内，标明为A;寺(毗化样品)和B管(不自先化样品。与此同时，男称样品，按GB3523-83 (谷类、油料作物种f水分测k立法测定水分含量。谷类籽粒的称样量g 样111i7 i 名柏:散化样口口口不散化样品;.K.种飞0.7或0.80.5或0.6普通五米0.8 0.6 II1J赖氢酸1-米0.7或0.50.5或0.4f白j粱1.
7、0 0.7 3豆类0.5 0.4 t:称样;过系根据试验j!t定的，如果剩余染料溶液的浓度超出1.2-1.8mM时，称样i正应作适当调整。5.3 内航化反应各ri;别)JII人2.00mI16%乙酸铀溶液(和b稻加8%乙酸铀溶液)，然后)1l0.20ml丙酸四千于A管中，JJllO.20ml缓冲溶掖t:B1击中。盖紧塞f，放置振荡机上振荡十分钟。5.4 染料结合反应向A，8轩rj分别)JlI人20.00ml3.89mM染料溶液，盖紧塞子，置振荡机上振荡一小时(水稻两小时)。5.5 离心将I二述反应波于3000- 4000r / min F离心十分钟。5.6 贝IJ在GXD -201型蛋白质分析
8、仪或GXDL-202型蛋白质赖氨酸分析仪上测定上洁掖(即剩余染料溶被)的透元率T值或吸光度E值。注:股谷类样品丙自先化反应和染料结合反应不得低于10.C，水稻样品还应在18- 34.C f i茬行。2 GB 4801-84 6 结果计算6.1 计算公式由测得的透光率T值或吸光度E值，从标准曲线上查出或用回归方程计算得到相应的剩余染料溶液的浓度(mM)，则样品中赖氨酸含量的计算公式为赖氨酸(%，-f基=c.89 -1.CB WB(l-H) 3.89 -1.11 xC A、WA (1 -H) .J 146.2 一一一一一x100 1000 20 一一-一1o 式中:C A, CB一一分别为酷化与不
9、酷化样品的剩余染料溶攘浓度，mM; WA、WB一一分别为酌化与不散化样品的称样量，g; H一一样品的水分率z20一一加人染料溶液体积，时，1. 11- (20 + 2 + 0.2 )与20之体积比53.89一-酸性橙12染料溶液浓度，mM; 146.2-一-lmol赖氨酸的质量，g。6.2 结果的表示两个兰卡行样品的测定结果用算术平均值表示，小数点后保留两位，第三位小数按GB1.1-81(标准化工作导则编写标准的一般规定附录C规定取舍。6.3 允许差两个乎行样品赖氨酸测定值之差不得大于0.03%。3 GB 4801-84 附录A使用低浓度染料溶液测定法参考件A .1 本标准采用3.89mM酸性
10、橙12染料溶液。试验证明，使用1.284m M染料溶液，也得到与3.89mM近似的结果，只是在精密度和准确度方面稍差。但低浓度有其优点，即不论那类谷物，称样量一律定为0.18g0.2饵和0.13g，且可节约试剂及样品用量。A.2 用1.284mM染料榕液时，其测定方法除下述几点有所不同外，其余均与标准条文条款相同。A .2.1 种梓量均为0.18g梗稻为0.20g)和0.13g。A .2.2 绘制标准曲线z配制0.50、0.55、0.60、O.町、0.70、0.80、0.90mM的染料标准系列溶液用连续档测定，以1.284mM染料溶液调透光率为10，60ml 1. 284 mM染料溶液加140ml缓冲溶液调透光率为70)。附加说明z本标准由中华人民共和国农牧渔业部提出。本标准由中国农业科学院综合分析室查如璧主持起草。4 =-03白。华人民共和国家标准谷类籽粒赖氨酸测定方法染料结合赖氨酸(DBL)法GB 4801- 84 国中中国标准出版社出版北京复外三里河)中国标准出版社印刷车间印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售* 开本880X1230 1/16 印张1/2字数7.0001985年8月第一版1985年8月第一次印刷印数1-4.000 * 定价0.24元标目22-37书号I15169. 1- 3112 *
