1、 ICS 65.020.99 B 61 DB6111 杨 凌 农 业 高 新 技 术 产 业 示 范 区 地 方 标 准 DB 6111/T 1332019 谷子杂种快速鉴定技术规范 Technical Specification for Rapid Identification of Foxtail Millet Hybrids 2019-08-15 发布2019-09-01 实施杨凌示范区市场监督管理局 发 布 DB6111/T 1332019 I 前 言 本规范依据GB/T 1.1-2009给出的规定起草。本规范由杨凌示范区农业标准化技术委员会提出并归口。本规范起草单位：西北农林科技大学
2、。本规范主要起草人：冯佰利、袁雨豪、杨璞、高小丽、王鹏科、高金锋、宋慧、梁鸡保。有关专利的说明按照GB/T 1.1-2009中附录C进行。本规范首次发布。DB6111/T 1332019 1 谷子杂种快速鉴定技术规范 1 范围 本规范规定了谷子杂种快速鉴定的术语和定义、鉴定步骤及鉴定结果汇总。本规范适用于谷子F1代杂合单株的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8232 粟（谷子）GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方
3、法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 亲本 Parents l i nes 杂交育种中所选用的雌雄性个体。3.2 杂种 F1 Hybri d F1 采用温汤杀雄、阳光杀雄或人工去雄等方法去雄后授粉，获得的F1种子。3.3 SSR标记 Si mpl e Sequence Repeats marker 一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，是一类由几个核苷酸（一般为16个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。4 鉴定步骤 4.1 基因组 DNA提取 选取符合GB/T 8282的谷子杂交种，参照GB/T 30988提取基因组DNA，用超微量分光光度仪测定DNA含量，
4、用ddH2O稀释到所需工作浓度（30 ng/L）。试验所用试剂见附录A。4.2 PCR 扩增反应体系和程序 DB6111/T 1332019 2 4.2.1 扩增体系 反应总体积10 L，其中模板DNA样品（30 ng/L）2 L，10PCR buffer（Mg2+）1 L，dNTPs（2.5 mmol/L）1 L，Pri mer F（10mol/L）0.5 L，Pri mer R（10 mol/L）0.5 L，TaqE（5 U/L）0.1 L。试验所用试剂见附录A。4.2.2 反应程序 将反应体系混匀后进行PCR扩增：95 预变性3 mi n，95 变性30 s，50 65 退火45 s，7
5、2 延伸1 mi n，共35个循环，72 延伸10 mi n，16 保存。将扩增后的PCR产物加入2 L非变性6Loadi ng buffer，混合均匀，短时间内置于4 保存，长时间内置于-20 保存备用。扩增产物用8%聚丙烯酰胺检测。4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 4.3.1 制胶 洗涤：将A、B板洗涤至清水无阻力流下，竖立晾干。封底：每板15 ml 8%聚丙烯酰胺，加入150 L 10%过硫酸铵和15 L四甲基乙二胺，聚合1 mi n。分离胶：每板25 ml 8%聚丙烯酰胺，加入100 L 10%过硫酸铵和50 L四甲基乙二胺，聚合1 h。4.3.2 电泳 待凝胶1 h后，将与6Loadi
6、 ng buffer混合后的PCR扩增产物每个点样孔加入3 L。电泳缓冲液为 1TBE，150V180 V恒压条件下电泳1.5 h2 h。4.3.3 银染 固定：将完成电泳的胶块放入固定液中，振摇12 mi n以上。银染：固定完成后，倒出固定液，加入银染液，振摇12 mi n。脱色：银染完成后，倒出银染液，加入ddH2O，振摇1 mi n。显影：脱色完成后，倒出ddH2O，加入300 mL现配的显影液，待谱带清晰（以Marker为准）后照相并记录带型。4.3.4 亲本间多态性 SSR 标记筛选 用附录B中的SSR引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出亲本间差异性标记。结果记录见表
7、1。表1 亲本间多态性引物记 引物编号 所在染色体位置 多态性引物位点数 4.3.5 F1杂合性鉴定 用亲本间存在差异的标记，对相应F1进行单株检测。同时具有父母本的条带或只具有父本条带的为真杂种；仅具有母本条带的为假杂种。结果记录见表2。DB6111/T 1332019 3 表2 F1 多态性检测结果记载表 杂交组合号 母本 父本 SSR 引物组合 F1基因型 5 鉴定结果汇总 所有鉴定数据、表格、图片整理后归档保存。保存F1真杂种及对应的亲本组合。DB6111/T 1332019 4 A A 附 录 A（资料性附录）实验相关试剂 A.1 实验相关试剂 A.1.1 10%CTAB溶液的配置
8、称取10 g CTAB加入80 mL ddH2O，置于65 C水浴锅内加热至溶解，用ddH2O定容至100 mL。A.1.2 1 mol/L Tri s-HCl 溶液的配置 称取12.114 g Tri s，溶于80 mL ddH2O中，用浓盐酸约500 l 调节pH至8.0，用ddH2O定容至100 mL。A.1.3 0.5 mol/L EDTA溶液的配置 称取14.615 g EDTA，加入80 mL ddH2O，加入约7 g固体氢氧化钠，边加边搅拌，调节pH至8.0，用ddH2O定容至100 mL。A.1.4 5 mol/L NaCl 溶液的配置 称取29.22 g NaCl，加入80
9、mL ddH2O，置于水浴锅内加热至完全溶解，用ddH2O定容至100 mL。A.1.5 氯仿:异戊醇（24:1）用100 mL量筒量取氯仿96 mL，加入4 mL异戊醇混溶。A.1.6 1.6Loadi ng buffer溶液的配置 量取100 mL去离子甲酰胺，2 mL 0.5 mol/L EDTA，称取0.25 g二甲苯菁，0.25 g溴酚蓝，充分混匀。A.1.7 10TBE溶液的配置 称取108 g Tri s、55 g硼酸和40 mL 0.5 mol/L EDTA溶于ddH2O中，置于磁力搅拌器上充分混匀，调节pH至8.0，用ddH2O定容至1 L。A.1.8 8%非变性丙烯酰胺凝胶
10、母液的配置 称取78 g丙烯酰胺和2 g甲叉丙烯酰胺，加入100 mL的10TBE溶液，置于磁力搅拌器上充分混匀，用ddH2O定容至1 L，放置于-4 C保存备用。A.1.9 10%APS 称取10 g过硫酸铵，加入100 mL ddH2O，充分混匀，放置于-4 C，保存备用。A.1.10 固定 用量筒量取270 mL ddH2O，30 mL无水乙醇，1.5 mL冰乙酸充分混匀。A.1.11 银染液 DB6111/T 1332019 5 称取0.6 g硝酸银，加入300 mL ddH2O，充分混匀，放置于棕色容器中，避光保存。A.1.12 显影液 称取4.5 g氢氧化钠，加入300 mL dd
11、H2O，3 mL甲醛，充分混匀（现配现用）。DB6111/T 1332019 6 B B 附 录 B（资料性附录）SSR多态性引物 B.1 SSR多态性引物 见表B.1。表B.1 SSR多态性引物 引物编号 引物序列（53）退火温度（）CAAS9006 F:CTGCTGCAAGCAGCGACTCCG R:CGAGGTTAGAGGCGATCCCCCA 60 CAAS9030 F:GCAAGCAACAGTCCATGGCCGA R:GCTGCGAGCTTGCGTGACAGA 60 CAAS8001 F:ACCAGCACAAGCCACACGCA R:TGGCAACAACCAAATTAAGGGCCA 6
12、0 CAAS8003 F:TTATGCCAATGTCCCCGGCGGT R:CGCCGTTTCCGATCCAAGGCAT 60 CAAS7051 F:GCCCCGGACATAGTTGTTACTG R:TTGTCGCGTTAGCTTAGGATGA 60 CAAS7005 F:GCGTGGAGTCCTCTACCTTTTAT R:TCCTCTTTTCTCCTTTTGTGCT 55 CAAS7014 F:GGCTCTCGAGTGTCCTCTCTCT R:AGCAGCAAGAAATGGTGTGTGT 55 CAAS7018 F:CGTAGCTACTTGTTCCACGAGCA R:CCGCGACTTCAT
13、CAGTGAATATC 55 CAAS7045 F:CGTCTCCTGAACCAAGCCTATC R:TCTCCTCCTCATCTTGGGTTTC 55 CAAS6069 F:CGCATTGAAAATCCTCCTTC R:CCCAACCTAGCCAACCAGT 50 CAAS6091 F:CATAAAAATCTCAGCCCCAAAC R:GTAGCATCTCATGGCTTTAGCA 50 CAAS6079 F:CAGCAGTCATGGATAGTCTCG R:TACAGCATCCGGTTTCCAAT 50 CAAS5003 F:ACCCCATCCCCATGTGTGTTTTCCA R:AGCAGG
14、CCTCAACGGCCCAAAT 55 CAAS5011 F:TTGGAGCGTAGCGCATCAGGCA R:AGCCCCTCCGTCTCTCTCACCACAT 55 CAAS5036 F:AAAGGTAGCCAGCTGCCCCGTGAT R:TGGTTCCATGTGGCCAGAAAAGAAAGC 55 DB6111/T 1332019 7 表B.2（续）引物编号 引物序列（53）退火温度（）CAAS4011 F:TCGCTGCAACCAAAAGCTACCTGCGCC R:TGGGGCGGAGCCACTGGGAGTCAATAA 60 CAAS4025 F:TACAGGCCGGTCACCAGC
15、ACAGCAGAT R:CGGAACTGCCTGACCGGAAAAGTCGCA 60 CAAS4033 F:TCAGCTCACCCCTCTCAACCCGACT R:AGGGGCTAGCTTCAATGGTGGGGGA 60 CAAS4040 F:GCAGCACCGTCAAGGTTCCTATCGCAT R:TGGCAGCACAGTAGCGTCCTTTTGCTT 60 CAAS3056 F:TGCGCAGGCAGCTTGTTGTTGT R:AATCGGATTTCCCTCCGCCCGT 55 CAAS3010 F:TGCGTGTGGCGATGTGAGATGGA R:ACCATCGGTTTCGTGGCT
16、TGGC 55 CAAS3020 F:CGGCCGATCCAACCTCAGGTACTGT R:TCTGCGACCGTTGACAAAGCCCT 60 CAAS3038 F:TGGCTGTTGCTGAACCCGTCGT R:GCAGATCAGCCACCACCCAAGAAGC 55 CAAS2002 F:TTGGCCAGCACGTACGACCCACACT R:TGGATGGGTTGGGTGGCGCACAAGA 60 CAAS2036 F:TCGATTACGGTCCCGGTCCCTCTCCAT R:TGTATGAACACGCCTGTGCGCCGAC 60 CAAS2064 F:TCGCTTCCGTCC
17、TTTGTTCCCGCACT R:TCGGGTGCACCATTTGATCCGGCCA 60 CAAS2042 F:AGGCGCGCATTGGCATTGTCATCCCGT R:TGCGGTCGTTGTTGTACAGGGGCGCAT 60 CAAS1014 F:GTTAATTAGTGGCAATCCATGC R:CCTCTTGAGAGGTGGAATTATTATG 50 CAAS1043 F:GCTAGGCATGACTCACCTGCTACTGA R:GGGGGTTGGAGCCTGGAGGA 60 CAAS1048 F:GTGGCAATCAAGTGAACCTCGGGA R:GAGCAGCAGATATGGCGCTACCAC 60 CAAS1027 F:TGGGTTCCTTGTCGGCCTCGT R:AGCCCAGCTGTCTGACAAGAAGGT 55 _
