1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜进出口食品中隐孢子虫检测方法犘犆犚法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犘犆犚犿犲狋犺狅犱发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本标准的附录为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李晓虹、闫东丽、韩伟。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售进出口食品中隐孢子虫检测方法犘犆犚法范围本标准规定
2、了食品中隐孢子虫的检验方法。本标准适用于果汁、牛奶、叶类蔬菜及水果、贝壳类中隐孢子虫的快速检验。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。生活饮用水标准检验方法微生物指标分析实验室用水规格和实验方法（，：）基因检验实验室技术要求定义、术语和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。定义和术语隐孢子虫犮狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿隐孢子虫为顶端复合体门、孢子虫纲、球虫亚纲、
3、真球虫目、艾美球虫亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属。是直径在（）（）的极微小的，无法以肉眼辨识的单细胞寄生虫。隐孢子虫寄生于人或动物的胃肠道上皮和呼吸道上皮微绒毛，其隐孢子虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。感染多经过食源性或水源性传播途径感染。目前公认的隐孢子虫有效种为个种。其中感染人最主要的是微小隐孢子虫（犆狆犪狉狏狌犿）。缩略语犐犕犛犻犿犿狌狀狅犿犪犵狀犲狋犻犮狊犲狆犪狉犪狋犻狅狀免疫磁珠分离。犚犉犔犘犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犉狉犪犵犿犲狀狋犔犲狀犵狋犺犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿限制性片段长度多态性分析。设备和材料电子天平：感量为。显微镜：倍。离心机：。恒温水浴锅：，。扩增仪。犛犖犜版权所有 禁止
4、翻制、电子传阅、发售电泳仪。磁极和混匀器。微波炉。紫外检测仪或凝胶成像系统。微量可调移液器：，。卡（公司或同类产品）。直径打孔机（公司或同类产品）。振荡器。摇床。过滤均质袋（）（法国犐狀狋犲狉狊犮犻犲狀犮犲，公司或同类产品）。试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。抗隐孢子虫磁珠试剂盒（丹麦公司或同类产品）。抽提试剂盒。犜犪狇犜犪狇、（）、其他稳定剂和增强剂：北京天为时代公司或同类产品。（）。琼脂糖。溴化乙锭。引物：见表。表隐孢子虫引物序列及扩增片段长度扩增引物名称引物序列（）扩增片段大小注：为（正向），为（反向）。纯化试剂：公司或同类产品。卡洗液：，；，公司或同类产品。（牛
5、血清白蛋白）。盐酸（）。氢氧化钠（）。电泳缓冲液（储备液）：碱、冰乙酸、（），用蒸馏水定容至，混匀，室温保存。使用时取电泳缓冲液，稀释为工作液即可。犞狊狆限制性内切酶：公司或同类产品。犛狊狆限制性内切酶：公司或同类产品。质控标准卵囊：微小隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿狆犪狉狏狌犿）、贝氏隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售狉犻犱犻狌犿犫犪犻犾犲狔犻）、安氏隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犪狀犱犲狉狊狅狀犻）、犬隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犮犪狀犻狊）或适宜的隐孢子虫卵囊。阴性质控菌株为适宜的非隐孢子虫卵囊。检验步骤方法提要食品经处理
6、后，用方法分离纯化隐孢子虫卵囊，再用卡提取，以提取的为模板进行巢式扩增，琼脂糖凝胶电泳检验产物是否有特征条带，从而对食品中隐孢子虫进行快速检验。如有必要，可鉴定到种。检验程序隐孢子虫检验程序见图。图隐孢子虫犘犆犚检验程序检测步骤食品样品处理对于饮料类样品直接以无菌操作取样品进行下一步的操作。对于叶类或贝壳类样品称取放入过滤均质袋中，加入双蒸水，密封后放至摇床上轻轻振荡，将滤液倾倒入个离心管中，犵离心；去上清液，用双蒸水重悬个离心管中沉淀物及部分上清液，将重悬物转移至另一离心管，总体积不得超过，然后进行下一步的操作。隐孢子虫卵囊的分离与纯化将处理好的样品，用抗隐孢子虫磁珠试剂盒分离纯化隐孢子虫卵
7、囊，其操作参照说明书，最后得到的卵囊悬液进行下一步的抽提。保存剩余分离纯化好的隐孢子虫卵囊，以备确证试验使用。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售模板犇犖犃提取将上述分离纯化好的隐孢子虫卵囊约滴加到卡上，按卡操作说明书提取模板。所提取的模板，可常温下储存，也可直接放入管中进行后续反应。巢式犘犆犚扩增（可参照相关试剂盒操作说明）初始（）：反应体系为模板（中制得的滤膜片一片），犜犪狇；引物各；双蒸水。反应条件：预变性；变性，退火，延伸，个循环；延伸。扩增产物长度为。巢式（）：反应体系为模板（第一轮产物），；引物各；双蒸水；反应条件：预变性；变性，退火，延伸，个循环；延伸。扩增产物长度为。质量控
8、制检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为中所列的隐孢子虫卵囊或适宜的质控隐孢子虫卵囊，阴性对照为非隐孢子虫卵囊，空白对照加入无菌水作为对照。巢式犘犆犚扩增产物电泳检验用电泳缓冲液配制琼脂糖电泳凝胶（溴化乙锭终浓度达到），制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将第二轮扩增产物点样，同时加入。恒压，电泳。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。结果及判断犘犆犚扩增产物电泳检验结果隐孢子虫扩增产物为。结果判断阴性对照和空白对照均未出现特征条带；阳性对照出现预期大小的特征条带；待测样品出现预期大小的特征条带，怀疑存在隐孢子虫，需进一步确证；待测样品未出现预期大小的扩增
9、条带，为阴性结果。确证试验将中出现特征性条带对应的卵囊，参照方法进行镜检鉴定。结果表述扩增产物电泳检验结果阳性，且经确证为阳性，报告检出隐孢子虫。扩增产物电泳检验结果阴性，报告未检出隐孢子虫。微小隐孢子虫种鉴定犚犉犔犘分析中确证为阳性的产物用犞狊狆、犛狊狆限制性内切酶进行酶切。犞狊狆限制性内切酶的反应体系为：，犞狊狆酶，第二轮巢式产物，反应。犛狊狆限制性内切酶的反应体系为：，犛狊狆酶，第二轮巢式产物，反应。犞狊狆、犛狊狆限制性内切酶酶切反应产物电泳检验操作步骤同。结果表述经犞狊狆酶酶切产物电泳分别得到、片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售经犛狊狆酶酶切产物
10、电泳分别得到、片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。经犞狊狆酶或犛狊狆酶酶切产物电泳未得到、或、片断结果的，报告未检出微小隐孢子虫。废弃物处理和防止污染的措施检验过程中防止交叉污染的措施按照附录的规定执行。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施犃抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，高压灭菌，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。犃检测过程犃实验室应分为样品制备区、前区、区和后区。将模板提取、反应液配制、循环扩增及产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。犃实验过程
11、中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。犃各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。犃所有溶液、水、耗材和器具要，高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在贮存的试剂中，可加入的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。犃模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。犃前区中，最好能在操作箱中加入反应各组分。犃实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的。犃可使用和系统控制污染。犃应遵循操作的其他要求。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中隐孢子虫检测方法犘犆犚法中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售
