1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2206.1一2008化妆品微生物检验方法第1部分:沙门氏菌Method of microbiology examination for cosmetics一Part 1 : Salmonella 2008-11-18发布2009-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 本部分的附录A为资料性附录。. - 目U雷本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SNjT 2206.1-2008 本部分起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳
2、出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人:李志勇、王志强、李晓虹、郑晶、石磊、凌莉、易敏英、高东徽、吕敬章、陈涧、胡科锋、许龙岩、黄晓蓉、曹以诚。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 2206.1一2008化妆品微生物检验方法第1部分:沙门氏菌第一法常规培养法1 范围SN/ T 2206的本部分规定了化妆品中沙门氏菌的常规检验方法。本部分适用于化妆品中沙门氏菌的检验。2 规范性引用艾件IS0 6579 食品微生物学3 材料与设备3. 1 吸管:2mL，分刻度0.1m 3.2 灭菌平皿:直径90mm，底3. 3 100 mL=角瓶。3.4 接种针、接种环。3
3、.5 灭菌的样品处理器具:慑子3.6 灭菌小试管:3mmX50 mm 3. 7 可调移液器:10L100L， 3.8 天平:量程og500 g，精度O.1 g: 3.9 高压灭菌器。3. 10 冰箱:0C4 C。3.11 乳被分散机(转速1000 r/min以上)。3. 12 恒温培养箱:36.C士1.C、42.C:!:l C。3, 13 显微镜:10X100X。3.14 VITEK全自动微生物鉴定系统或类似设备。的条款。凡是注日期的引用文分，然而，鼓励根据本部分达成的引用文件，其最新版本适用于本,IS0 3696:1987 ,MOm 注VITEK是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出
4、这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。4 培养基和试剂4.1 SCDLP液体培养基:按G/T7918. 1中规定JSN/T 2206.1一20084.2 四硫酸铀煌绿(TTB)增菌液:按GB/T4789.28-2003中4.14、4.15规定。4.3 亚硫酸钻琼脂(BS):按GB/T4789. 28-2003中4.19规定。4.4 DHL琼脂z按GB/T4789. 28-2003中4.20规定。4.5 HE琼脂z按GB/T4789.28-2003中4.21规定。4.6 WS琼脂:按GB/T4789.28-2003中4
5、.23规定。4. 7 SS琼脂:按GB/T4789.28-2003中4.22规定。4.8 三糖铁琼脂:按GB/T4789.28-2003中4.26、4.27规定。4.9 蛋白陈水、能基质试剂2按GB/T4789.28-2003中3.13规定。4.10 尿素琼脂(pH7.2):按GB/T4789.28-2003中3.15规定，4. 11 佩化押(KCN)培养基:按GB/T4789.28-2003中3.16规定。4.12 氨基酸脱竣酶试验培养基:按GB/T4789.28-2003中3.12规定。4.13 糖发酵管z按GB/T4789.28-2003中3.2规定。4.14 ONPG培养基g按GB/T
6、4789.28-2003中3.3规定。4. 15 半固体琼脂z按GB/T4789. 28-2003中4.30规定。4. 16 丙二酸饷培养基:按GB/T4789. 28-2003中3.7规定。4.17 沙门氏菌因子血清:按26种用于初步分型;57种用于进一步分型;163种用于详细分型。4.18 API20E测试条。4.19 GNI+测试卡。注:API20E测试条和GNI+测试卡是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯一认可.如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。5 检验程序5.1 方法提要化妆品中沙门氏菌的检验方法是通
7、过前增菌、选择性增菌、分离、生化鉴定、血清学分型鉴定等方法对化妆品中可能存在的沙门氏菌进行定性检验。5.2 检验程序沙门氏菌的检验程序见图1。2 SN/T 2206.1-2008 样品10g(lO mL)制成1; 10稀释液10 mL稀释液加入90mL SCDLP增菌液36 C:t 1 C 18 h-24 h 10 mL SCDLPJf!商结养液加入100此TIB糟菌液42 C士1C18 h-24 h 36 C士1C18 h-24 h 挑选可疑菌藩，接种TSI、蛋白陈水缸基D、尿素CpH7.2)、KCN、赖氨酸生化试验或API、GNI鉴定试验圄1检验程序6 梓晶制备参照GB/T7918. 1进
8、行制样。7 检验步骤7. 1 前增菌和增菌取1: 10样品稀释液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中，置培养箱36.C土1.C培养18h 24 h。移取10mL，转种于100lllL四硫酸铀煌绿(TTB)增菌液内，42.C土1.C培养18h24 h。7.2 分离按GB/T4789.4-2003中6.2规定。7.3 生化反应按GB/T4789.4-2003中6.3规定的生化反应，也可采用API20E、GNI+测试卡或其他等效产品。7.4 血清学分型鉴定按GB/T4789.4-2003中6.4规定。7.5 结果报告综合生化反应和血清学鉴定结果，按GB/T4789.4-2003中6.5判定菌
9、型，并报告结果。3 SN/T 2206.1-2008 第二法环介导恒温扩增CLAMP)法8范围SN/ T 2206的本部分规定了化妆品中沙门氏菌的LAMP检验方法。本部分适用于化妆品中沙门民菌的快速检验。9 缩略语下列缩略语适用于SN/T2206的本部分。9. 1 Betaine 甘氨酸三甲内盐。9.2 Bst酶BstDNA BsL DNA聚合酶(大片段)。9. 3 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸。脱氧核昔三磷酸。9. 5 EDT A ethylenediamine 乙-二股四乙酸。9.6 LAMP loop-medialed 环介导恒温扩增。9.7 PCR
10、polymerase chain reactlon 聚合酶链式反应。9. 8 Trito X-100 聚乙二醇辛基苯基醋。10 防污染措施参照WS/T230中第6章。11 原理LAMP是一种连续、恒温、基于自技术。耳目序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独?IrstI酶启动白换反应。在靶标DNA区启动互补链合戚，结果在同一链上互补序列周击?霄形成有很歹穷的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。12 设备和材料12. 1 设备一次性
11、于套、移液器(量程O.5L到1000L)、抢头、1.5 mL塑料离心管、1.5 mL离心管架、计时器、冰盒、高速台式离心机、水陆锅或加热模块等。12.2 引物根据妙门氏菌属特有的靶序列agfA设计一套特异性引物，包括外引物l、外引物2和内引物l、内引物2。4 SN/T 2206.1-2008 外引物扩增片段长度:200bp。12.3 检测试Ja) 样品预处理掖2成分包括Tris-HC1pH8. O ,EDTA.Triton X-100; b) 反应液z主要成分dNTP.Tris-HC1pH8. 8.MgS01 ,Triton X-100.Betaine.内/外引物;c) DNA聚合酶:s(酶;
12、d) 显色液;e) tY门氏菌LAMP检测试剂盒:试1fIJ盒组成、说明及使用注意事项参见附录A。注:由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯认可。如果其他等效产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品。13 检测程序化妆品中沙门氏菌LAMP固2栓验程序14 操作步骤14. 1 样品制备、增菌培养和分离样品制备参照GB/T7918. 1进行。增菌培养和分离按7.17.2规定。14.2 细菌模板DNA的制备14.2. 1 增菌液模板DNA的制备对于14.1方法培养的增菌液:a) 直接取该增菌液1mL加到1.5 mL无菌离心营中.10000 r/min离心2min.
13、尽量吸弃上清液;5 SN/T 2206.1-2008 b) 加入80L样品预处理液，棍匀后沸水浴10min，置冰上10min; 。10000r/min离心2min，上清液即为核酸模板p取上清液置-20-C可长期保存备用。14.2.2 可疑菌落模撮DNA的制备对于14.1方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入80L样品预处理液，再按照14.2. 1 b)步骤制备模摄DNA以待检测。也可使用等效的商品化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNAD14.3 核酸扩增14. 3. 1 反应过程a) 在向上述2L核酸模板见14.2.1c)J中加入23L扩增液(参见表1);b) 65 c温育9
14、0min。表1LAMP反应体系试剂贮备液浓度25L反应体系中加样体积/L沙门氏菌反应液22L Bst酶8U/f1L lL DNA模板2L 注1:沙门氏菌反应液与B5t酶混合液即为扩增液，注2:每次反应必须设置阴性和阳性各一个质控.14.3.2 阴性对照、阳性对照设置阴性对照设为LAMP反应的空白对照(以样品预处理液代替DNA模极)。阳性对照采用已知浓度的沙门氏菌标准菌株DNA溶液作为LAMP反应的模板。14.3.3 LAMP反应体系常规LAMP反应体系见表1。14.4 结果观察在上述反应管中加入lL显色液，轻轻温匀即可判定结果;建议在黑色背景下观察。建议使用LAMP试剂盒专用反应管，将反应液和
15、显色被一次性加入，DNA扩增反应后可不必开盖即可观察结果。14.5 结果判定6 在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下za) 待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为抄门氏菌初筛阳性，采用样品增菌液或纯菌落进步按7.37. 5步骤进行确认后报告结果;b) 待检样品反应管液体呈橙色则可报告沙门氏菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应重新检测。SN/T 2206.1-2008 附录A(资料性附录)沙门氏菌LAMP检测试剂盒A.l 试荆盒组成每个试剂盒(20T/kit，每个反应体系体积为25L)包括的成分见表A.1。表A.1组成成分规格DNA提取液l管，1.5
16、 mL 沙门氏菌反应液l管，500LBst酶l管.30L显色液25管.1L/管沙门民菌阳性对照DNAl管.50LLAMP反应专用管25个A.2 说明a) 反应液中含有特异性引物及各种离子;b) 扩增试剂【见14.3.1a)J的配制:反应液22L与Bst酶1L混匀即可pc) LAMP反应专用管己含显色液。A.3 使用注意事项a) 严格执行行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范;b) 本试剂盒仅用于体外检测，开始检测前要仔细阅读试剂盒说明书全文;c) 试剂盒内各试剂使用前，充分融化后稍离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡，反应前注意检查各反应管是否盖紧，以免、泄露污染仪器;d) 试剂盒内的阳性对照应视为具有污染性物质，应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错误检验结果。
