1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 41732025 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术规范 Technical specification for the diagnosis of bovine Escherichia coli diarrhea 2025-08-29 发布2025-09-29 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 41732025 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件
2、由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、北京生泰尔科技股份有限公司、北京华夏兴洋生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、通辽市科尔沁区畜牧水产工作站、内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：徐晓静、谢梦圆、张勇、王秀敏、赵卓、陈坚、韩四娥、张迪、达来宝力格。DB15/T 41732025 1 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术规范 1 范围 本文件规定了牛大肠杆菌性腹泻的临床诊断和实验室诊断技术。本文件适用于牛大肠杆菌性腹泻的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的
3、条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。EAEC：肠黏附性大肠杆菌(Enteroaggregative Escherichia coli)DEC：致泻大肠杆菌(Diarrheagenic Escherichia coli)EHEC：肠出血性大肠杆菌(E
4、nterohemorrhagic Escherichia coli)EIEC：肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive Escherichia coli)EPEC：肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli)ETEC：肠产毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)EMB：伊红美蓝(Eosin-methylene Blue)PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease）MAC：麦康凯琼脂(Mac Conkey Agar)MLST：
5、细菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing)STEC：产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli)5 临床诊断 流行病学 DB15/T 41732025 2 5.1.1 易感性 不同品种牛均易感，多见于3周龄以内的犊牛，7日龄内犊牛最易感。5.1.2 流行性 一年四季均可发生，尤以气候多变、寒冷季节和环境卫生较差时多发，呈地方性流行或散发。5.1.3 传染源及传播途径 病牛和带菌牛是主要传染源，通过粪便排出病菌，污染水、饲料、乳头和皮肤等，当犊牛吮乳、舐舔或饮食时，经消化道感染。此外，也可经脐带或产道感染。临床
6、症状 多数是7日龄以内犊牛发病，病初体温升高至40 以上，数小时后开始腹泻，有的病牛体温可降至正常。初期腹泻物呈黄色粥样，后期呈灰白色水样，有的混有未消化的凝乳块、血液及泡沫，有酸臭气味。末期犊牛肛门失禁，常腹痛，用蹄踢腹部。有的病程长的犊牛表现发育迟滞和呼吸困难等症状。有的犊牛出现腹泻后急性死亡。病理变化 皱胃黏膜和小肠黏膜充血、水肿，可能见出血斑点。肠系膜淋巴结肿大。胆囊严重扩张，充满暗绿色胆汁。心外膜和心内膜散在或弥漫分布出血斑点。急性炎性脾肿，脾脏肿大和质软，部分病例脾脏表面可见出血斑点，其它组织器官也可能见出血斑点。经脐带感染的病例可见出血性脐炎和出血性脐动脉炎。病程长的病例可能伴有
7、浆液纤维素性关节炎和出血性或浆液性出血性肺炎。6 实验室诊断 主要仪器设备 恒温培养箱（37 2）、漩涡振荡器、倒置显微镜、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、微量可调移液器（规格100 L1000 L、20 L200 L、1 L20 L）、高速台式冷冻离心机（4，离心速度12000 r/min 以上）、冰箱（2 8、-20 和-70）、自动微生物生化鉴定系统。主要试剂 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase污染的容器分装。生理盐水、营养琼脂平板、细菌微量生化反应管及指示剂、无霉水、PCR酶、DNA Marker（DL 500、DL 2000）。样品采集与处理
8、 6.3.1 生物安全措施 样品的采集按照NY/T 541的规定进行。样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。6.3.2 粪便样品 DB15/T 41732025 3 将无菌棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集刚排出的新鲜粪便。分别放入盛有灭菌生理盐水的采样管中，编号并记录相关信息。6.3.3 组织样品 取病死牛肠组织及内容物、脐带、肝、脾等，置于采样杯内。病原检测 6.4.1 细菌分离 无菌条件下，将样品接种于MAC或EMB琼脂平板，37 2 培养 16 h24 h，观察菌落特征。在MAC琼脂平板上，多数大肠杆菌呈桃红色或粉红色菌落，有的也呈无色菌落；在EMB琼脂平板上，多数
9、大肠杆菌呈紫黑色带金属光泽的菌落，有的呈无色或琥珀色半透明菌落。挑取单个疑似菌落接种于MAC或EMB琼脂平板，37 2 培养16 h24 h进行鉴定。6.4.2 革兰染色镜检 挑取MAC或EMB琼脂平板上的大肠杆菌特征性菌落，经营养琼脂平板纯化后制备涂片，自然干燥，革兰染色，镜检可见两端钝圆的粉红色革兰阴性短杆菌，散在或成对存在。6.4.3 生化鉴定 根据伯杰细菌手册对大肠杆菌进行生化特性鉴定。挑取符合大肠杆菌形态学特征的单个菌落接种细菌微量生化反应管，进行甲基红试验、吲哚（靛基质）试验、枸橼酸盐试验、V-P试验、硫化氢试验、三糖铁试验、尿素酶试验、糖类分解试验（葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖）等
10、甲基红试验、吲哚试验、葡萄糖和甘露糖发酵试验结果呈阳性，枸橼酸盐试验、V-P试验、尿素酶试验结果呈阴性，三糖铁琼脂斜面呈黄色、底层产气，几乎不产生硫化氢，大多数菌株可迅速发酵乳糖，仅极少数迟发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖，符合以上生化反应说明符合大肠杆菌特性。也可用自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。6.4.4 PCR 鉴定 6.4.4.1 DNA 提取 将采集的样品进行处理，按DNA提取试剂盒方法提取核酸。-20 以下保存。6.4.4.2 DEC PCR 检测 按照GB 4789.6对DEC（ETEC、EHEC、EIEC、EPEC、EAEC、STEC）进行PCR检测。6.4.5 测序鉴定（
11、选做）细菌全基因组测序、16S测序、MLST等测序技术进行鉴定。6.4.6 致病性鉴定（选做）取健康状态良好小白鼠，分成试验组和对照组。将符合6.4.2和6.4.3或6.4.4或6.4.5结果的大肠杆菌菌株，按照细菌生长曲线制备不同浓度的菌悬液，腹腔注射试验组小鼠。注射后观察5 d7 d，若对照组小鼠均正常，试验组小鼠精神萎靡，食欲减退至废绝，静止抱团，腹泻或死亡，无菌条件下取死亡小鼠的组织样品分离细菌，进行革兰染色镜检、生化鉴定或PCR鉴定。DB15/T 41732025 4 7 综合判定 疑似 符合5.1、5.2、5.3，或者6.4.2、6.4.3，可判定为疑似牛大肠杆菌性腹泻。确诊 符合 7.1，结合 6.4.4、6.4.5、6.4.6 任一结果为阳性，可确诊为牛大肠杆菌性腹泻。
