1、c 53 中口口口因，、玉WS/T 116 1999 LTSE Microbiological examination of food hygiene一Rapid LTSE method for determination of Coliform bacteria 1999- 01-21发布1999- 07 -01实施中华人民共和国卫生部发布寸 WS/T 116-1999 前圭主缸工2在食品微生物安全监测中，国际上通常采用正常的肠道细菌作为粪便污染指示菌，而不是直接测定肠道致病菌。本标准是在总结国内外同类技术经验基础上发展起来的，在研制时结合我国国俏，设计了适合国内特点，便于基层单位推广应用的
2、一种新的快速简便检测方法。l 随着食品工业的高速发展，大肠茵群更是卫生微生物学的一项重要监测指标。根据中华人民共和国食品卫生法的要求，企业产品要做到生产一批、检验一批，合格批，销售一批(简称四个一)的重要管理措施，因此寻求一种快速、简易而又准确的检验方法，则是长期以来国内外学者在探索的一项科研工作.大肠茵群LTSE快速检验方法的建立是在不影响准确性和特异性的前提下.加快大肠菌群的检出，该方法取样和查MPN检索表的报告方式与国际或国内外通用标准方法相同，但是培养基和检验方法与国际标准和国内外新制定的标准却不同。至目前为止，国际或国外通用检测大肠茵群方法的定义还会包括一些对发酵乳糖产气的非肠杆菌科
3、细菌.本方法能加快目的菌生长，其灵敏度为1-3个/mL大肠菌群，37C15h有初步结果，所创用的这种新的证实试验能进一步排除非肠杆菌科细菌对乳糖发酵产气，因此本标准方法体现了灵敏快速、特异准确、经济简便、提高功效等特点，并且应用范围广泛，与法定常规方法一致，可检测多种食品，是一种有效检测各类样品的快速检验大肠菌群方法，在应用时能节材、省时、省力，减轻检验人员的劳动强度，适合于各级卫生监督单位的监测和食品工业单位的质量检查。本标准的附录A、附录B都是标准的附录。本标准的附录C是提示的附录。本标准由卫生部卫生法制与监督司提出.本标准起草单位z湖南省湘潭市卫生防疫站。本标准主要起草人z涂楚国.本标准
4、由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。卫生行业标准食品卫生微生物学检验大肠菌群LTSE快速检验方法WS/T 116-1999 Microbiological examination of food hygiene Rapid LTSE method for determination of Coliform bacteria 1 范围本标准规定了食品中大肠菌群的LTSE快速诊断标准方法和判断结果原则。本标准适用于各种食品、餐具和各种饮用水的大肠茵群快速测定。本标准方法检出的大肠茵群的含量，表明被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。2 引用标准下列标准所包含的条文，通
5、过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效.所有标准都会被修订，使用标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 1. 1一1993标准化工作导则第1单元.标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定GB/T 4789.3-1994食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB/T 5750-1985 生活饮用水标准检验法3 定义本标准采用下列定义。大肠茵群Coliformbacteria 大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧在37C生长时能使乳糖发酵，在本法培养基中15h内产酸产气，氧化酶试验阴性的革兰氏阴性无芽胞杆菌，能符合此定义的细菌除以大肠埃希氏菌属为主外，还包
6、括肠杆菌科的拧核酸菌屑、肠抨茵属和克雷伯氏茵属细菌.这些细菌都存在于人的粪便内，故此作为粪便污染指标来评价食品卫生质量具有广泛的意义.食品中大肠茵群数系以每100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。4 原理不同的细菌以不同途径分解糖类，在其代谢过程中均能产生丙酬酸及转变为各种酸类，大肠茵群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生氢和二氧化碳气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。根据这个原理，将样品接种到LTSEBOth内15h，看结果有无产气现象，然后加氧化酶试验和涂片草兰氏染色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。中华人民共和国卫生部1999-01-21批
7、准1999- 07 -01实施1 WS/T 116-1999 材料5 5. 1 高压蒸气灭菌器.5.2 干热灭菌箱。5.3 恒温箱.5.4 天平。5.5 均质器。5.6 显微镜。5.7冰箱。5.8 接种环.5.9载玻片.5.10 试管、童汉氏小管、tJl度吸管等，置于干热灭菌箱中160C灭菌2ho 培养基和试剂6 6.1 LTSE培养基肉汤(I号)0 6.2 氧化酶试剂。6.3 革兰氏染液.本方法中，除化学纯BR)生化试剂外，所用的化学试剂为分析纯(AR)，试剂用水为蒸馆水., 检验程序7 大肠茵群检验程序如图1所示.检样+ 稀料+ LTSE:lt酵管37士1 15 h + 产气氧化酶试验厂一
8、一阴性阳性大肠荫群阴性报告大肠茵群阳性报告大肠菌群检测程序涂片革兰民主民色厂一革兰氏阳性革兰氏阴性+ 无芽胞忏茵大肠菌群阴性报告图1不产气+ 酣性v告姗阴、报操作步骤B 8. 1 检样稀释8. 1. 1 以无茵操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内，经研磨或充分振摇溶解成为1 10的均匀稀释液.固体检样最好用均质器，以800010 000 r/min的速度处理1min 做成1I 10的均匀稀释液.2 丁WS/T 116-1999 B. .2 用1mL灭茵吸管吸取1, 10稀释液1mL.注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1, 100
9、的稀释液。8. 1.3 另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次10f古递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭茵吸管.8. 1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。8.2 预测试验将待检样品接种于LTSE发酵管内，接种在10mL或10mL以上者，用双料LTSE发酵管.1mL 及1mL以下者，用单料LTSE发酵管。食品样稀释方法同常规方法(GB/T4789.3)采用9管法，每一稀释度接种3管，置37C土1C温管内，培养15h士1h观察结果，如有混浊并产气者，即表示为阳性管.以上阳性管继续按下列程序做证实试验。8.3 证实试验8.3. , 菌液涂片s
10、用直径3-4mm的接种环挑取菌液2-3环进行萃兰氏染色，镜检，有革兰氏阴性无芽胞杆菌，而杂菌无或少。8. 3. 2 氧化酶试验:产气管取约0.5-1mL培养物，滴加试剂2-3滴摇匀，显粉红色或深红色示为氧化酶阳性，不变色或呈试剂的本色为阴性反应。9 结果判断和报告如有产气，氧化酶阴性并从形态上见到革兰氏阴性的无芽胞杆菌，表示有大肠商群存在，然后查MPN检索表，计算MPN值。食品卫生报告每100mL(g)大肠茵群的最可能数查表1。表l每100mL(g)食品标准中大肠茵群最可能数(MPN)检索表阳性管数MPN 95%可信限1 mL(g)X3 0.1 mL(g)X3 0.01 mL(g)X3 100
11、 mL(g) 下限上限。30 。l 30 5 90 。2 60 。3 90 。l 。30 5 130 。l l 60 。1 2 90 。1 3 120 。2 。60 。2 I 90 。2 2 120 。2 3 160 。3 。90 。3 l 130 。3 2 160 。3 3 19口1 。40 5 200 l 。1 70 10 210 I 。2 110 1 。3 150 3 WS/T 116-1999 表1(完)阳性管数MP:-.! 95%可信限1 ,L(g)X3 0.lmL(g)X3 0.0Im(g)X3 100 mL(g) 下限上限l 1 。70 10 230 1 1 l JlO 30 3
12、60 1 1 2 150 I 1 3 190 1 2 - 。JlO 30 360 l 2 l 150 1 2 2 200 1 2 3 240 l 3 。160 1 3 1 200 1 3 2 240 l 3 3 290 2 。90 10 360 2 。l 140 30 370 2 。2 200 2 。3 260 2 1 。150 30 440 2 1 I 200 70 890 2 1 2 270 2 l 3 340 2 2 。210 40 470 2 2 l 280 100 1 500 2 2 2 350 2 2 3 420 2 3 -;-。290 2 3 1 360 2 3 2 440 2
13、3 3 530 3 。230 40 1 200 3 。l 390 70 1 300 3 。2 640 150 3800 3 。3 950 3 1 。430 70 2100 3 l 1 750 140 2300 3 l 2 1 200 300 3800 3 l 3 1 600 3 2 。930 150 3800 3 2 1 1500 300 4 400 3 2 2 2 100 350 4700 3 3 3 2900 3 3 。2400 360 13000 3 3 1 4600 710 24000 3 3 2 Jl 000 1 500 48000 3 3 3 ;24 000 注l 表l采用3个稀释
14、度1mL(g)、0.1mL(g)、0.01ml.(g刀，每稀释度3管.z 表l内所列检样量如改用10mL(g)、1ml.(g)和0.1mL(g)表内数字相应降低10倍，如改用0.1mL(g)、0.01 mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字相应增加10倍，其余类推.4 A1 成分乳榕胶蛋白陈SDS 氯化纳磷酸氢三销(无水磷酸二氢何(无水)微量元素浓浓蒸馅水A2 制法5g 20 g 0.5 g 5日5.74 g 1 g 0.5 mL 1 000 mL WS/T 116-1999 附录A(标准的附录)LTSE 培养基肉汤的制备将上述各团体成分加到蒸馆水中.加热溶解.pH为7.0士l冷却后再
15、加微蛙元素;有液0.5mL.边加边摇匀，分装入有童汉氏小管的试管各5mL。双料成分均加倍，即将上述LTSE肉汤液浓缩二倍配制，分装入内有章汉氏小管的试管各10mL(仅分装30mL的供酱油及酱类检验用).梵高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌2030mn.贮存于4C冰箱或阴凉处备用。A3 用途大肠菌群的发酵培养基。A4 其他若做水样采用二倍浓缩LTSE培养基液，其培养基分装试管量和样品量按常规方法(GB/T5750) 进行.附录B(标准的附录)LTSE标准方法证实试验的试剂制备B1 1 yo盐酸二甲基对苯二胶试液B1.1 配制称取盐酸二甲基对苯二胶O.1 g.溶于蒸缩水10mL即得。此液应新鲜少最配
16、制，于冰箱内避光保存.B1.2 用途和结果供氧化酶试验用.本法阳性者，菌液立刻呈粉红色，并逐渐加深，阴性者菌液不变色或呈该试剂的本色.5 WS/T 116-1999 B2 染液配制B2.1 结晶紫染液结品紫(cystalviolet)95%乙醇1. 0 g 20 mL 1%草自直接(NH.)，C，.J水溶液80 mL 将结晶紫溶解于95%乙醇中后，与草酸钱溶液相混合，静iI:48 h使用。此染液稳定，直密闭的棕色瓶中可储存数月。B2.2 革兰氏腆液础片1. 0 g liJI!化饵2.0 g 蒸馆水300 mL 先用35mL蒸馆水溶解腆化饵，再加映片，待全部洛解后，加蒸馆水平带释至300mL，贵
17、密闭棕色瓶中，备用。B2.3 脱包液:95%乙醇B2.4 沙黄(番红)染液沙黄(Saframine0) 0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馅水适量将沙黄溶解于95%乙辞中，待完全溶解再加蒸馆水至100mL. B3 染色法B3.1 用直径为34mm的接种环沾取产气阳性管的茵液34环置于清洁载玻片上，涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰23次，以固定涂片。B3. 2 滴加结晶紫溶液，染色1min，7.K洗。B3. 3 滴加隙液，嫁染1min，水洗，甩干余水。B3.4 商加95%乙醇脱色约2030s.或将95%乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满涂片脱色10 S，水洗，吸干(脱色是本法关键技
18、术，脱色不足易染成阳性，脱色过度易染成阴性)。B3. 5 滴加沙黄复染液.染1min，水洗，待干。B4 镜检B4.1 染色结果2革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。附录C(提示的附录)正确使用本标准的说明C1 方法的研制与样品考核结果C1.1 LTSE法的敏感性与特异性用平板活菌计数LTSE法灵敏度为13个/mL.大肠茵群四个属菌株在LTSE培养基上37.C15h出现结果，采用多种常见的非大肠茵群的菌株检测不酵解乳糖产气，经试验证明本法灵敏度高，特异性强，比常规法节约经费82.58%以上。6 WS/T 116-1999 Cl.2 LTSE培养基的各种成分都是经过了很多试验反复摸索研制成功
19、的，其营养丰富，抑制杂菌效果强，具有加快目的菌生长发育和促进发醉缓慢的大肠菌群产股产气的效果。在证实试验中增加了氧化酶试验反应具有排除非肠杆菌科对乳糖发酵产气的特殊功能.根据本方法原理不必要加入指示剂，并便于做证实试验。C1.3 本方法研制成功后.经不同的卫生监测单位实验考核各类食品样品共计703件.结果与常规法总符合率为99.3%;而与美国标准(ANSDA-1快速法比较其特异性与敏感性为优。!ill-革兰民染色的涂片检查说明C2 本方法加有涂片检查，主要是进一步证实大肠菌群的形态，因本方法的LTSE培养基SOS加量大，SOS抑制革兰氏阳性菌效果好而不影响大肠菌群的生长，如果检验人员没有时间，
20、可以省去涂片镜检，结果的可靠性仍在99%以上.操作注意事项及经验介绍C3 C3.1 检样要严格遵守操作规程，避免技术操作的差错.由于大肠菌群是呈分裂繁殖生长，在水中往往具有聚集性，分布不均匀的现象，因此检样前固体和液体样如同常规法(GB/T4789.3)统一步骤经前处理后，注意稀释固体(或液体)样时，要充分溶解摇匀，使其目的菌分布均匀，每取样加入LTSE发酵管要自先混匀，避免或尽量减少取样误差.C3.2 培养基灭菌后，童汉氏小管应无气泡方能使用，做氧化酶试验的小试管要清洁干净。C3.3 本方法灵敏度高，37C15h 培养与常规符合率基本致(即99%-100%)，超过15h可提高检出率。C3.4 初次观察试管法氧化酶试验难以辨别真假阳性结果，可采用氧化酶阳性结果的非肠杆菌科菌株做阳性对照，如绿胶杆商、脑膜炎双球菌，弧茵科菌株等等.的22lUFF r f 阳的民中华人民共和国卫生行业标准食品卫生微生物学检验大肠菌群LTSE快速检验方法WS/T 116一1999镰中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码，100045电话，68522112中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版权专有不得翻印印张3/4字数16干字1999年8月第一次印刷句岳1/16 开本880X1230 1999年8月第一版印数1一1200 电&句&380-52 日标J
