1、ICS 67.120.30 B 52 备案号： 19162-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 371 2006 鳄龟 American Snapping Turtle 2006-07-25发布 2006-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 371 2006 I 前 言 本标准的附录 A为规范性附录。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：杨华莲、张黎、潘志、宣庭孝、高南、赵睿。 DB11/T 371 2006 1 鳄 龟 1 范围 本标准规定了鳄龟（ Chelydra Serpentina）的主
2、要生物学特性、肌肉营养成分分析、细胞遗传 学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性，以及检测方法。 本标准适用于鳄龟的种质鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款 通过 本标准的 引 用 而 成为本标准的条款。 凡是注日期 的 引 用文件， 其随后所有 的 修改 单（ 不包括勘误 的 内容 ） 或修订版均不 适用于本标准， 然而 ， 鼓励根据 本标准 达 成 协议 的 各 方 研 究是否可使 用 这些 文件的 最新版 本。 凡是不注日期 的 引 用文件， 其最新版 本适用于本标准。 GB/T 5009.3-2003 食品 中水分的测定 GB/T 5009.4-2003 食品 中 灰 分的测定
3、 GB/T 5009.5-2003 食品 中 蛋白 质的测定 GB/T 5009.6-2003 食品 中 脂肪 的测定 GB 17718-1999 鳙 GB/T 18654.2 养 殖鱼类 种质检 验 第 2部 分： 抽样 方法 GB/T 18654.12-2002 养 殖鱼类 种质检 验 第 12部 分： 染色体组型 分析 3 名称与分类 3.1 学名 鳄龟（ Chelydra Serpentina ） 3.2 分类位置 鳄龟 科 （ Chelydridae） ,鳄龟 属 （ Schweigger），鳄龟（ Chelydra Serpentina ）。 4 主要生物学特性 4.1 外部形态特
4、征 4.1.1 外形 头伸 出 体外 ， 不能缩入甲壳内 ， 上 下 颌略尖 ， 眼圆 。 尾长而尖 ， 尾两侧有 肉 突 ， 尾背前 2/3处有一 条 鳞皮状隆 起， 呈 锯齿 状 ， 皮呈 褐 色 。 被 壳 薄 而 坚 ， 边缘 有 许多齿 状突 起， 腹 甲 小 ， 腹 部 淡黄 色或 浅褐 色 。 前后 爪较 长 ， 趾间具蹼 ， 四肢较 长 且发 达 粗壮 。 背部 由 13枚 -15枚 背甲组 成， 有 3条 模糊棱 。 鳄龟 正面图见图 1， 腹面图见图 2。 DB11/T 371 2006 2 图 1 鳄龟正面图 图 2 鳄龟腹面图 (1)吻 (2)颈 (3)前 肢 (4)背
5、甲 (1)吻 (2)下 颌 (3)颈 (4)前 肢 (5)背甲 缘盾 (5)后 肢 (6)爪 (7)尾 (6)后 肢 (7)爪 (8)尾 (9)腹 甲 4.1.2 可数性状 椎盾 ： 5， 颈盾 ： 2， 肋盾 ： 8-10， 缘盾 ： 22， 臀盾 ： 2， 喉盾 ： 2， 肱盾 ： 2， 胸盾 ： 2， 腹盾 ： 2， 股盾 ： 2， 甲 桥 ： 6， 腋盾 ： 2， 侉盾 ： 2， 肛盾 ： 1-2。 4.1.3 可量性状 不 同年龄 组 的鳄龟 背甲 、 腹 甲长 和宽 的 实 测 值见表 1。 表 1 不同年龄组鳄龟背甲、腹甲长和宽的实测值（单位： cm） 组 别 项目 1龄 2龄
6、3龄 4龄 背甲长 13.44 0.49 16.90 0.35 20.10 0.85 22.70 0.56 背甲 宽 11.56 0.65 16.80 0.67 21.60 0.84 22.70 0.73 腹 甲长 10.65 0.52 12.10 0.53 13.80 0.72 16.00 0.58 腹 甲 宽 10.58 0.63 15.00 0.64 17.70 0.65 20.80 0.74 4.2 内部构造特征 4.2.1 脊柱骨 颈椎 8枚 ， 胸椎 10枚 ， 荐椎 2枚 ， 尾 椎 20枚 。 4.2.2 消化道 全 口 无齿 ，口 裂 有 角 质化 硬鞘 。 食 道 细 而长
7、 ， 胃较宽大 ， 小肠盘曲 位于 十二指肠 后 。 4.2.3 消化腺 由 肝 、 胰和胆等 组 成。 肝深褐 色 且较大 ，分 左右 两 叶 ， 胆囊在肝叶 中， 胰腺乳黄 色 紧靠十二指肠 。 4.2.4 肺 扁平 长圆 囊 状 ， 2叶 。 鳄龟的 内部 结构图见图 3。 DB11/T 371 2006 3 （ 1） 气 管 （ 2） 食 道 （ 3） 心脏 （ 4） 肝 脏 （ 5） 胃 （ 6） 胰 脏 （ 7） 肺脏 （ 8） 胆囊 （ 9） 卵巢 （ 10） 小肠 （ 11） 膀胱 （ 12） 脾脏 （ 13） 输卵管 （ 14） 肾脏 （ 15） 泄 殖 腔 （ 16） 副膀
8、胱 （ 17） 泄 殖 腔孔 图 3 鳄龟（ 雌 性） 内部 结构图 4.3 生长 不 同年龄 组 鳄龟的 体 重与 体 厚 实 测 值见表 2。 表 2 不同年龄组鳄龟的体重、体厚实测值 组 别 项目 1龄 2龄 3龄 4龄 体 重 （ g） 926.40 100.42 1200 120.52 1900 145.38 2700 210.45 体 厚 （ cm） 6.89 0.40 7.3 0.53 9.8 0.41 11.2 0.40 4.4 繁殖 4.4.1 性成熟年龄 3龄 -4龄 。 4.4.2 繁殖季 节 4月 -6月 。 4.4.3 年性成熟 次 数 性成 熟个 体 性 腺 每 年
9、 成 熟 一 次 ， 一 次 产 卵 。 4.4.4 产卵 量 每只 性成 熟雌 龟 每 年 产 卵 20枚 -80枚 。 5 肌肉营养 成分 5.1 主要 营养 成分 鳄龟肌肉 蛋白 质、 粗 脂肪 、 灰 分、水分 等 营养 含量 指 标 见表 3。 DB11/T 371 2006 4 表 3 肌肉 （ 后肢基 部）主要 营养 成分 检测 项目 营养 指 标（ %） 粗 蛋白 19.32 粗 脂肪 0.40 灰 分 0.88 水分 77.9 5.2 氨基酸含 量 表 4 肌肉 （ 后肢基 部）主要 营养 成分 检测 项目 氨基酸含量 （ %） 天门冬氨酸 1.65 苏氨酸 0.86 丝氨酸
10、 0.83 谷氨酸 2.95 甘氨酸 1.00 丙氨酸 1.10 胱氨酸 0.20 缬氨酸 0.88 蛋 氨酸 0.52 异亮氨酸 0.85 亮氨酸 1.45 酪氨酸 0.68 苯丙氨酸 0.71 赖氨酸 1.52 组 氨酸 0.60 精氨酸 1.10 氨基酸 （以 鲜基计 ） 总量 17.68% 脯氨酸 0.78 6 细胞遗传 学特性 6.1 体 细胞染色 体 2倍 数 2n=52 6.2 核型公式 12m+4sm+6st+2t+28cm NF=68 6.3 染色 体组 型 鳄龟 染色体 中 期 分 裂 相 见图 4 ， 染色体组型 见图 5。 DB11/T 371 2006 5 图 4 染
11、色 体 中期 分 裂相 图 5 染色 体组 型 7 生化 遗传 学特性 肌肉的 乳 酸脱氢酶 （ LDH） 同 工酶 有 8条 谱带； 肝 脏 的 酯酶 （ EST） 同 工酶 有 5个基因座 位， 有 5条 谱 带 。 肌肉的 乳 酸脱氢酶 （ LDH） 同 工酶电泳 图 谱 见图 6。 肝 脏 的 酯酶 （ EST） 同 工酶电泳 图 谱 见图 7。 图 6 肌肉 的 乳酸脱氢酶 （ LDH）同 工酶电泳 图 谱 图 7 肝脏 的 酯酶 （ EST）同 工酶电泳 图 谱 8 分 子遗传 学特性 用 20个 RAPD（ 随 机扩增 多 态 性 DNA技术， 又称任意 引 物 PCR） 引 物
12、 对 其 基因 组 DNA进行 分析， 确认 引 物 S19 的分析 结 果 能 够反应 其 基因 组 的 多 态 性特 征 。 引 物 S19序 列： tgcccgtcgt见图 8。 O O Est-5 Est-4 Est-3 Est-2 Est-1 DB11/T 371 2006 6 图 8 基因 组 DNA RAPD图 谱 M：分子 量 标准 C： 对照 样品 G：鳄龟 样品 （ 4个 样品 ） 9 检 测方 法 9.1 生物学性状测 定 参照 GB 17718规定的方法测定。 9.2 肌肉营养 成分测 定 9.2.1 样品制 备 取活 体后 肢 基 部 肌肉，于 105烘干 ， 粉碎
13、。肌肉 各 成分测定 按照 GB/T 5009.3、 GB/T 5009.4、 GB/T 5009.5、 GB/T 5009.6规定的方法 进行 。 9.2.2 氨基酸 取活 体后 肢 基 部 肌肉，于 105烘干 ， 粉碎 。肌肉 各 成分测定 按照 GB/T 5009.3、 GB/T 5009.4、 GB/T 5009.5、 GB/T 5009.6规定的方法 进行 。 9.3 细胞遗传 学特性 检 测 根据 GB/T 18654.12的 相关 规定 进行 。 9.4 生化 遗传 学性状分 析 9.4.1 样品制 备 样品 加 3%辅 酶 I液匀浆 ， 低温离 心 ， 至 上 清液澄清 。
14、整 个 制备 过 程 均 在 低温 下 操作 。 9.4.2 电泳 分 析 使 用水 平 淀 粉 凝胶 电泳 仪 。 淀 粉 胶浓度 为 10%， 酯酶 （ EST） 电泳 缓冲液 为 三羟 甲 基氨基 甲 烷 （ Tris） -硼 酸 -乙 二 胺 四 乙 酸 四 钠盐 ， 乳 酸脱氢酶 （ LDH） 电泳 缓冲液 为 甲 基氨基 甲 烷 （ Tris） -柠檬 酸 ， pH值 7.0。 将 10%浓度 水 解淀 粉 煮好 后 倒 入 制胶 模 内 ， 待凝固 后 ， 切 一 横 裂 缝 ，用 滤纸片吸 取 样品 的 上 清液插 入 裂 缝 中。 电泳电 压 为 250V， 电泳 8h-10
15、h， 电泳 恒温 4 ， 电泳 后 横切 成 0.2cm左右 的 薄 片 ， 浸 入染色 液 中 保 温 染色 。 同 工酶 染色 液配 方 见 附录 A。 9.4.3 结果判定 将 测定 结 果对照 图 6、 7谱带确 定 该 种 同 工酶 的 编码 座 位 数 和多 态座 位的 基因 数 。 9.5 分 子遗传 学特性分 析 9.5.1 基因 组 DNA的 提取纯 化 DB11/T 371 2006 7 取 肌肉 剪 碎 用 组 织 列 解液 （ 0.5mol EDTA， PH值 8.0； 200 g/mL ProteinnseK； 0.5% Snrcosyl） 于 55 消 化 过 夜
16、， 次 日 用 酚 、 氯仿 、 异 戊醇 （ 24： 24： 1） 抽 提 三 次 ， RNaseA消 化 去除 RNA后 再 抽 提 一 次 ， 然后 用 2150mmol/L Tris. HCl(pH 8.0)、 10 mmol EDTA（ pH 8.0）， 透 析 至 OD270 0.05，检测 DNA浓度 ， 置 4 保存备 用。 9.5.2 RAPD 引物 及扩增条 件 用 PE-9600型 PCR扩增 仪 ， RAPD扩增 引 物 OPP及 OPM组 计 15个 。 RAPD反应 ： 10mmol/L Tris.HCl （ pH 8.3）， 50 mmol/L KCl， 2.0
17、mmol/L MgCl 2， 0.001%明胶 ； Dapt.dGTP、 Dctp， dTTP各 为 0.1 mmol/L:引 物 15 g， 基因 组 DNA 20 g ， 1单位 Tag聚合 酶 。于 93.5 变 性 1min， 36 退火 1min， 72 延 伸 2min， 计 45个 循 环 ， 循环 结 束 后 延 伸 5min， 扩增 产物用 1.5%琼 脂 糖凝胶 电泳 检测。 9.5.3 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度 为 1.5%的 琼 脂 糖 ， 胶 中 含 0.5g/mL溴 化 乙锭 。 电泳 缓冲液 为 TBE， 电泳 在 室温 下 进行 ， 电 压 为 15V， 电泳
18、时 间 为 16h。 电泳 毕 在 紫 外 灯 下 观察 拍 照 。 10 检 测规 则 10.1 检 测分类 检测分为鉴定检测 和 质 量 一 致 性检测。 10.2 检 测 项目 鉴定检测 项目 包括外部 形 态 特 征 、 可 量 性 状 、 可 数 性 状 。质 量 一 致 性检测 项目 包括 细胞遗传学特性、 生化遗传学特性、分子遗传学特性。 10.3 取样 样品 龟的 抽样 按 GB/T 18654.2规定 执 行 。 10.3.1 组 批 以 同龄 期 的鳄龟为 同 一 批 。 10.4 判定 规 定 各 项 检 验 指 标 在 标准范 围 内 则判 定为鳄龟 良 种。 DB11
19、/T 371 2006 8 附 录 A （规范性 附录 ） 同 工酶染色液配 方 A.1 酯酶染色液配 方 酯酶 染色 液配 方 见表 A.1 表 A.1 酯酶染色液配 方 -乙 酸 萘 酯 （ mg） 坚 牢蓝 B盐 （ mg） 三羟 甲 基氨基 甲 烷 -柠檬 酸 缓冲液 （ 1mol， PH 7.0） (mL) 蒸馏 水 (mL) 40 100 10 10 A.2 乳酸脱氢酶染色液配 方 乳 酸脱氢酶 染色 液配 方 见表 A.2。 表 A.2 乳酸脱氢酶染色液配 方 乳 酸 钠 (mL) 辅 酶 I(mg) 氮蓝 四 唑 (mg) 吩嗪 甲 硫 酸 (mg) 三羟 甲 基氨基 甲 烷 -柠檬 酸 缓 冲液 （ 1mol， PH 8.6） (mL) 蒸馏 水 (mL) 0.5 6 2 1 10 10
