1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验Microbiological examination of food hygiene Examination of S阳1phylococcasaareas 1 主.内容与适用范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。2 引用标准GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养蓦和试剂3设备和材料3. 1 显微镜。3.2温箱，36士1。3. 3 离心机3,4 灭菌吸管：1mL,10 mL。3,5 灭茵试管。3. 6灭菌平血。3. 7均质器。3. 8载玻片。3.9 L型
2、涂布棒3. 10酒精灯3. 11 接种环。4 培”基和试剂4. 1 腆酶陈大豆肉汤：按GB4789. 28中4.59规定。4.2 7.5%氯化销肉汤：按GB4789. 28中4.61规定。4,3血琼脂平板s按GB4789. 28中4.6规定4. 4 Baird Parker琼脂平板2按GB4789. 28中4.60规定。4. 5 肉浸液肉汤z按GB4789. 28中4.1规定4.6 灭菌盐水4. 7兔血浆g按GB4789. 28中4.63规定。中华人民共和国卫生部19943-18批准GB 4 7 8 9. 1 0 94 代替GB4789. 10-84 1994-09一01实施479 5检验程序
3、金黄色葡萄球菌检验程序如下z&i,d-p,k，平板o. 3mL、O3mL、0.4mL Z4h 血平植36土1C Z4h 6操作步骤6. 1 增菌培养法6. 1. 1 检样处理睡片!.Ii!色GB 4789. 10 94 栓样Z5g(mL) + ZZ5mL灭菌生理盐在观察榕血报告7. 5%姐化制肉汤或腕酶在大亘肉汤36土1C z4h 血平板，frdP.,.ke平板36士lC Z4h 血辈凝固离试验称取25g固体样品，吸取25mL液体样品，加入225ml，灭菌生理盐水，团体样品研磨或置均质器中制成混悬液。6. 1. 2增菌及分离培养吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化锅肉汤或膜酷陈大豆肉汤50
4、mL培养基内，置36土1温箱培养24h，转种血平板和BairdParker平板，36士l培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固爵试验。6. 1.3形态本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无英膜，致病性葡萄球茵茵体较小，直径约为0.5 1 mo 6. 1. 4 在肉汤中呈混浊生长，在膜酷陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌
5、落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪癖解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥6. 1. 5血浆凝固酶试验480 . GB 4 7 8 9. 1 0-94 吸取1I 4新鲜兔血浆。.5 mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉寝液肉汤培养物o.5 mL，振荡摇匀，放36士l温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。6. 2 直接计数方法6. 2. 1 吸取上述1I 10混悬液，进行十倍递次稀释，
6、根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL, 分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3 mL、o.3 mL、0.4 mL，然后用灭菌L梯涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36士1温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。6.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36士124 h培养后进行染色镜检、血浆凝固离试验，步骤同增菌培养法。6. 2. 3 菌落计数z将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固部阳性数，除以5，再乘以稀稀倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。481 Al 设备和材料
7、A 1. 1 均质器A 1. 2冰箱。A 1. 3 离心机A 1. 4 分液漏斗A 1. 5 透析袋A 1. 6 振荡培养箱或普通温箱：“士l。A 1. 7灭菌吸管：1mL、10mLo A 1. 8 电线。Al. 9载玻片。A 1. 10二角瓶：250mL。GB 4 7 8 9. 10-94 附录A葡萄球菌肠霉素楼验参考件）A 1. 11 直径150mm大平皿（或带盖搪瓷盘）。A 1. 12玻璃纸A 1. 13银子。A 1. 14 一角棒。A 1. 15 直径2.5 mm打孔器。A 1. 16有机玻璃模板。A 1. 17橡皮圈A 1. 18 细滴管。A 1. 19 层析柱：40mmX20 25
8、 mm。A 1. 20酶标测定器。A 1. 21 洗瓶。A 1. 22微量加样器：200mL、50mL。A2培弊基和试JA2. 1 肠毒素产毒培养基按GB4789. 28中4.87规定。A2. 2 蕾养琼脂。A2. 3 1%琼脂糖（O.9%生理盐水配制）溶液。A2. 4 0. 2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液A2. 5三氯甲烧。A2. 6 6 mol/L盐酸溶液。A2. 7 5 mol/L氢氧化纳A2. 8生理盐水。A2. 9 I%乙酸溶液。A2. 10 0. I%唾嚓红R或氨基黑BoA2. 11 硅胶或凡士林。A2. 12 A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。482 . GB 4
9、 7 8 9. 1 0-94 A2. 13竣甲摹纤维素（CM22或CMllWhatman）。A2. 14 0. 008 mol/L pH5. 6磷酸盐缓冲液A2. 15 0. 008 mol/L pH6. 8磷酸盐缓冲液。A2. 16酶标记A、B、C、D肠毒素抗血清或酶联免疫试jf!j盒。A2. 17 0. 1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液。A2. 18 0. 05%0. 02mol/L pH7. 2吐温20缓冲液。A2. 19邻苯二胶酶底物A2. 20 2 mol/L硫酸。A3检验程序A3. 1 从商株中检测肠毒素从菌株中检测肠毒素程序见图Al,菌株图AlA3. 2从食物检样中提取和
10、检测肠毒素A3. 2. 1 微玻片法检测肠毒素（浓缩法层析法）程序见图A2,483 GB 4789.10-94 固体检样IOOg加入o2mol/LpH7. 5爵醺盐攫冲液IOOmL.4C攫泡1824h，檀体被样直接吸取！OOmL图A2层析法A3. 2. 2酶联免疫法检测肠毒素程序见图A3,484 GB 4789. 10-94 用。.Jmol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液幡膏血滑，加入苯乙烯凹孔板0.2mL,36士IC 3om;n 图A3A4 肠霉素俭溃lA4. 1 从菌株中提取肠毒素方法A4. 1. 1 液体透析培养法g用宽2.5 cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析
11、袋装入250mL三角瓶内，加入15mL灭菌生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121高压灭菌30min，待测的菌株接种营养琼腊斜面（试管18mm180mm),37培养24h，用生理盐水5mL洗下菌落，倾入上述培养瓶中，每个菌种种一瓶，37C振荡培养48h，振速为100次mino吸出菌液离心，8 000 r /min 30 min，取上精液做双相琼脂扩散，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，或用多聚乙二醇，浓缩至12mL，再做琼脂扩散。A4. 1. 2 固体透析培养法z向直径150mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾入灭菌产毒培养基约100120 mL，凝固后表面铺一灭商玻璃纸，待测菌株接种在
12、营养琼脂上，37培养24h，用约3mL灭菌盐水洗下菌苔，倾在玻璃纸上，用灭菌三角棒涂满平皿，37培养48.h，加入1020mL灭菌生理盐水，用灭菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液离心，以下步骤闰液体透析培养法。A4. 2从食品中提取肠毒素方法A4. 2. 1 直接浓缩法z取食品样品100g,:IJU入无菌。.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4浸泡1824h，用纱布过滤将滤液离心8000 r /min20 min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL 三氯甲饶，振播10min ，静置，将底层三氯甲烧弃去（如不分层，可8000 r/min离心20min）。加入6 mol/L盐酸溶
13、液调pH至4.5,8 000 r/min离心20min，取上液，加5mol/L氮氧化纳溶液，调pH至7. 5，离心取上精液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇上浓缩至12mL，做微玻片双485 GB 4789. 10-94 向琼腊扩散。A4. 2. 2 层析法如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馆水洗下，装入透析袋，以0.008 mol/L pH5. 6磷酸盐缓冲液平衡，加入CM层析柱内，流速I2mL/min，用0.008 mol/LpH5. 6磷酸盐缓冲被洗脱，再用0.2 mol/LpH6. 8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻
14、片双向琼脂扩散，检测肠毒素。A4. 3 双向琼脂扩散检测肠毒素A4. 3. 1 微玻片法将在95%乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干，吸取榕化的0.2%琼脂糖（蒸馈水配制滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放无尘的环境中干燥，先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中！可孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放入加有湿棉球的容器内，放25301824 h观察结果。可在灯光上，并对着睹的背景观察，在抗血清和提
15、取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。A4. 3. 2玻片法z吸取溶化的1%琼脂糖2.5 mL，铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5 mm的金属打孔器打成幅射型，孔距为2.5 mm，中心孔加入肠毒素抗血清，周围六个孔加入菌株或食品的肠毒素提取液，放入有滴加2/10000兰氮化纳湿棉球的容器内，以保持湿度。置25301820h，观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。A4. 3. 3染色法z用微菠片法取下胶带和有机玻璃模板，玻片法可直接将玻片放入蒸馆水中浸泡48 h，中间换23次水，在下述各液中浸10min,10%乙酸中含1%唾嚓红R（或氨基黑）;1%乙酸，1%
16、乙酸含1%甘泊，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖J滤纸，吸去多余液体，在室温或35烘干。阳性者沉淀被染料颜色，可长期保存。A B lt照肠毒章时照腼毒章一/ /( / 酷检样抗血清植栓样幢幢样抗血清被检样 幢幢样瞌幢样图A4A一被检样无肠毒素，为阴性；B被检样3.5含肠毒素，为阳性；4无肠毒素，为阴性A4.4 酶联免疫法检测肠毒素（双抗体法）A4. 4. 1 包被抗体：用0.1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5周mL，加入洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2 mL，置36土I30min，弃去上液。A4. 4. 2 洗涤z用。.05% O. 02 mol/L pH7. 2吐
17、温20缓冲液洗涤5次，A4. 4. 3 加入检样：如为液体，可直接加入o.2 mL，团体样品取100g，加入0.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液100mL，均质后取过滤液0.2 mL. A4. 4. 4 洗涤z同A4.4. 2. A4. 4. 5 每孔内加入酶抗体O.2 mL，置36土l30min，同时做阳性和阴性对照。弃去上液。A4. 4. 6 洗涤g同A4.4. 2。A4. 4. 7 每孔内加入邻苯二胶酶底物溶液o.2 mL，室温放置30min . 86 GB 4789. 10 94 A4. 4. 8 每孔内加入2mol/L硫酸。.05 mL，立即放酶标仪比色。A4. 4. 9结果判定样品OD值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。附加说明本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由北京市卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人刘以贤。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。,187
