1、 中华人民共和国国家标准GB 4789.352010食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 National food safety standard Food microbiological examination: Lactic acid bacteria 中华人民共和国卫生部发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 GB 4789.352010 I 前 言 本标准代替 GB/T 4789.35-2008食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验。 本标准与 GB/T 4789.35-2008相比，主要变化如下： 修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数
2、方法。 本标准的附录 A为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB 4789.35-1996、 GB/T 4789.35-2003、 GB/T 4789.35-2008。 GB 4789.352010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（ lactic acid bacteria）的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
3、于本标准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（ Lactobacillus） 、双歧杆菌属（ Bifidobacterium）和链球菌属（ Streptococcus） 。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱： 36 1 。 4.2 冰箱： 2 5 。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平：感量 0.1 g。 4.5 无菌试管： 18 mm180 mm、 15 mm100 mm。 4.6 无菌吸管： 1
4、 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶： 500 mL、 250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS（ Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基：见附录 A 中 A.1。 5.2 MC 培养基（ Modified Chalmers 培养基）：见附录 A 中 A.2。 5.3 0.5 %蔗糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 GB 4789.352010 2 5.4 0.5 %纤维二糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.5 0.5 %麦芽糖发酵管：见
5、附录 A 中 A.3。 5.6 0.5 %甘露醇发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.7 0.5 %水杨苷发酵管：见附录 A中 A.3。 5.8 0.5 %山梨醇发酵管：见附录 A中 A.3。 5.9 0.5 %乳糖发酵管：见附录 A中 A.3。 5.10 七叶苷发酵管：见附录 A中 A.4。 5.11 革兰氏染色液：见附录 A中 A.5。 5.12 莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）：化学纯。 GB 4789.352010 3 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图 1。 图1 乳酸菌检验程序图 7 操作步骤 7.1 样品制备 7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 7.1.
6、2 冷冻样品可先使其在 2 5 条件下解冻，时间不超过 18 h，也可在温度不超过 45 的条件解冻，时间不超过 15 min。 乳杆菌计数 乳酸菌总数减去双歧杆菌与嗜热链球菌计数之和 挑取双歧杆菌或乳杆菌菌落接种于 MRS 琼脂平板，嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板（可选做） 报告 菌种鉴定 样品 25 g（ mL）+ 225 mL 无菌生理盐水 10 倍系列稀释 选择 2 个 3 个适宜稀释度，各以 0.1 mL 加入到 MRS 平板 进行涂布 选择 2 个 3 个适宜稀释度，各以 0.1 mL 加入到 MC 平板进行涂布 选择 2 个 3 个适宜稀释度，各以 0.1 mL 加入到莫匹罗星
7、锂盐（ Li-Mupirocin）改良 MRS 平板进行涂布厌氧， 36 1 ， 48 h2 h 需氧， 36 1 ， 48 h2 h 厌氧， 36 1 ， 48 h2 h 乳酸菌总数计数 双歧杆菌计数 嗜热链球菌计数 GB 4789.352010 4 7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取 25 g 样品，置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，于 8000 r/min 10000 r/min 均质 1 min 2 min，制成 1:10 样品匀液；或置于 225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min 2 min 制成 1:10 的样品匀液。 7.1.4
8、 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成 1:10 的样品匀液。 7.2 步骤 7.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的无菌试管中 （注意吸管尖端不要触及稀释液） ， 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 7.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1 次 1 mL 灭菌
9、吸管或吸头。 7.2.3 乳酸菌计数 7.2.3.1 乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择 2 个 3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MRS 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。 36 1，厌氧培养 48 h2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15min 内完成。 7.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个 3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）改良 MRS 琼脂平板，使用灭菌 L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两
10、个平板。 36 1，厌氧培养 48 h2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计， 选择 2 个 3 个连续的适宜稀释度， 每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液分别置于 2 个 MC 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。 36 1，需氧培养 48 h2 h 后计数。 嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为： 菌落中等偏小， 边缘整齐光滑的红色菌落， 直径 2 mm1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.4 乳杆菌计数 7.2.3
11、.1 项乳酸菌总数结果减去 7.2.3.2 项双歧杆菌与 7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。 7.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ colony-forming units， CFU）表示。 7.3.1 选取菌落数在 30 CFU 300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板
12、作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 GB 4789.352010 5 7.4 结果的表述 7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（ mL）中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（ 1）计算： (1) 式中： N 样品中菌落数； C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1 第一稀
13、释度（低稀释倍数）平板个数； n2 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d 稀释因子（第一稀释度） 。 7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU 300 CFU 之间， 其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CF
14、U 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.5 菌落数的报告 7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。 8 结果与报告 根据菌落计数结果出具报告，报告单位以 CFU/g（ mL）表示。 9 乳酸菌的鉴定（可选做） 9
15、.1 纯培养 挑取 3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板，乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板，置36 1 厌氧培养 48 h。 9.2 鉴定 9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。 9.2.2 涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为 0.5 m 2.0 m，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。 9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。 dnnCN)1.0(21+=GB 4789.352010 6 表1 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应 表2 嗜热链球
16、菌的主要生化反应 菌种 菊糖 乳糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 马尿酸 七叶苷 嗜热链球菌（ S.thermophilus） 注:+表示90以上菌株阳性；表示90以上菌株阴性。 菌种七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖干酪乳杆菌干酪亚种（ L.casei subsp. casei） 德氏乳杆菌保加利亚种（ L.delbrueckii subsp. bulgaricus） 嗜酸乳杆菌（ L.acidophilus） d 罗伊氏乳杆菌（ L.reuteri） ND 鼠李糖乳杆菌（ L.rhamnosus） 植物乳杆菌（ L.plantarum） 注 :+表示 90以上菌株阳性；表示 90以
17、上菌株阴性； d表示 11% 89%菌株阳性； ND表示未测定。 GB 4789.352010 7 附录 A （规范性附录） 培养基及试剂 A.1 MRS 培养基 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g牛肉粉 5.0 g酵母粉 4.0 g葡萄糖 20.0 g吐温 80 1.0 mLK2HPO47H2O 2. g醋酸钠 3H2O 5.0 g柠檬酸三铵 2.0 gMgSO47H2O 0.2 gMnSO44H2.05 g琼脂粉 pH 6.2 15.0 gA.1.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中， 加热溶解， 调节 pH， 分装后 121 高压灭菌 15 min 20 min。 A
18、.1.3 莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基 A.1.3.1 莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）储备液制备：称取 50mg 莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）加入到 50 mL 蒸馏水中，用 0.22 m 微孔滤膜过滤除菌。 A.1.3.2 制法 将 A.1.1 成分加入到 950 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，分装后于 121 高压灭菌 15 min20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至 48 ，用带有 0.22 m 微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐（ Li-Mupirocin）储备液加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐（ Li-
19、Mupirocin）的浓度为 50 g/mL。 A.2 MC 培养基 A.2.1 成分 大豆蛋白胨 5.0 g牛肉粉 3.0 g酵母粉 g葡萄糖 20.0 g乳糖 20.0 g碳酸钙 10. g琼脂 15.0 g蒸馏水 1 00 mL1中性红溶液 pH6.0 5.0 mLGB 4789.352010 8 A.2.2 制法 将前面 7 种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，加入中性红溶液。分装后 121 高压灭菌 15 min 20 min。 A.3 乳酸杆菌糖发酵管 A.3.1 基础成分 牛肉膏 5.0 g蛋白胨 g酵母浸膏 5.0 g吐温 80 0.5 mL琼脂 1.5 g1.6%溴甲酚
20、紫酒精溶液 1.4 mL蒸馏水 1 000 mLA.3.2 制法 按 0.5%加入所需糖类，并分装小试管, 121 高压灭菌 15 min 20 min。 A.4 七叶苷培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g磷酸氢二钾 1.0 g七叶苷 3.0 g枸橼酸铁 0.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL蒸馏水 100 mLA.4.2 制法 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解， 121 高压灭菌 15 min 20 min。 A.5 革兰氏染色液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g95乙醇 20 mL1草酸铵水溶液 80 mLA.5.1.2 制法 将结晶紫完
21、全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g碘化钾 2.0 g蒸馏水 300 mLA.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。 A.5.3 沙黄复染液 GB 4789.352010 9 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g95乙醇 10 mL蒸馏水 90 mLA.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。 A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加 95 乙醇脱色，约 15 s 30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.5.4.4 滴加复染液，复染 1 min。水洗、待干、镜检。
