1、岳昌中华人民共和国国家标准GB 5009.204-2014 .d 食品安全国家标准食品中丙烯酷肢的测定 2015”05-01实施2014-12-01发布中华人民共和国响非国家卫生和计划生育委员会叩气也gJ沪4叫丁叫问frL叫即卢二协民fGB 5009.204-2014 前本标准代替GB/T5009.204-2005食品中丙烯酷胶含量的测定方法气相色谱质谱（GC-MS)法。本标准与GB/T5009.204-2005相比，主要变化如下z一一增加第一法稳定性同位素稀释的液相色谱质谱质谱法z一一气相色谱质谱法将外标法改为稳定性同位素稀释法。I 1 范围食品安全国家标准食品中丙烯酷肢的测定本标准规定了食
2、品中丙烯酷腊的测定方法。本标准适用于热加工如煎、炙炜、蜡炜等食品中丙烯酷胶的测定。第一法稳定性同位素稀辑的擅相色谱质谱11贡谱法2 原理GB 5009.204-2014 本标准应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入13C3标记的丙烯眈胶内标榕液，以水为提取禧剂，经过固相萃取柱或基质固相分散萃取净化后，以液相色谱质谱质谱的多反应离子监测（MRM）或选择反应监测（SRM）进行检测，内标法定量。3 试剂和材料注2除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1 试荆3. 1. 1 甲酸（HCOOH）：色谱纯。3.1.2 甲蹲（CH30H）：色谱纯。3.1.3 正己烧（n
3、-C6H14）：分析纯，重蒸后使用。3.1.4 乙酸乙醋（CH3COOC2Hs）：分析纯，重蒸后使用。3.1.5元水硫酸铀（Na2S04):400，烘炜4h0 3.1.6硫酸镀（NH4)2S04o3.1.7 硅藻土：Extrelut20或相当产品。3.2 标准晶3.2.1 丙烯酷胶（CH2=CHCONH2）标准品纯度99%）。3.2.2 13C3一丙烯酷胶（13CH2=13CH13CONH2）标准品（纯度98%）。3.3 标准溶攘的配制3.3.1 丙烯酷股标准溶渣的配制3.3. 1.1 丙烯酣睡标准储备溶液(1000 mg/L) ：准确称取丙烯酷肢标准品，用甲障禧解并定容，使丙烯酷股浓度为10
4、00 mg/L，置20冰箱中保存。3.3.1.2 丙烯酷腔中间癖液(100mg/L）：移取丙烯酷胶标准储备潜液1mL，加甲醇稀释至10mL，使丙烯酷股浓度为100mg/L，置一20冰箱中保存。1 GB 5009.204-2014 3.3.1.3丙烯酷腊工作榕液I(10 mg/L）：移取丙烯酷肢中间溶液1mL，用0.1%甲酸溶液稀释至10 mL，使丙烯酷股浓度为10mg/L.临用时配制。3.3.1.4 丙烯酷胶工作搭被II(1 mg/L）：移取丙烯酷腊工作溶液I1 mL，用0.1%甲酸溶液稀释至10 mL，使丙烯酷股浓度为1mg/L.临用时配制3.3.2 13C3丙烯酷腹内标溶液3.3.2.1
5、13Ca丙烯眈胶内标储备溶液（1 000 mg/L) ：准确称取13Ca丙烯眈腊标准品，用甲蹲溶解并定容，使iaca丙烯酷股浓度为1000 mg/L，置一20冰箱保存，3.3.2.2 内标工作溶液(10mg/L）：移取内标储备禧液1mL，用甲酶稀释至100mL，使13Ca丙烯酣睡浓度为10mg/L，置20冰箱保存。3.3.3 标准曲线工作溜簸取6个10mL容量瓶，分别移取0.1mL、0.5mL、1mL丙烯酷股工作溶液11(1 mg/L）和0.5mL、1 mL和3mL丙烯酷胶工作需液I00 mg/L）与内标工作榕液(10mg/L)0.1 mL，用0.1%甲酸潜液稀释至刻度。标准系列榕液中丙烯酿肢
6、的浓度分别为10g/L、50g/L、100g/L、500g/L、1 000 g/L、3000 g/L，内标放度为100p.g/L。临用时配制。4 仪器和设备4.1 液相色谱质谱质谱联用仪CL巳MS/MS）。4.2 HLB固相萃取柱：6mL、200mg，或相当产品。4.3 Bond Elut-Accucat固相萃取柱：3mL、200mg，或相当产品，4.4 组织粉碎机。4.5 旋转蒸发仪。4.6 氯气浓缩器。4.7 振荡器。4.8 玻璃层析柱E柱长30cm，柱内径1.8cm。4.9 祸旋混合器。4.10 超纯水装置。4. 11 分析天平z感量为0.1mg. 4.12 离，bm z转速10000
7、r/min. 5 分析步骤5.1 试样制备5. 1. 1 样晶提取取50g试样，经粉碎机粉碎，20玲冻保存。准确称取试样1g 2 g（精确到0.001g），加入10 mg/L 13C3丙烯酷胶内标工作溶液10L（或20L），相当于100ng（或200ng）的13c3丙烯酷腔内标，再加入超纯水10mL，振摇30min后，于4000 r/min离心10min，取上清掖待净化。5.1.2 样晶净化注g任选下列一种方法进行净化2 . GB 5009.204-2014 5.1.2.1 基质固相分散萃取方法选择D：在试样提取的上清液中加入硫酸镀15g，振荡10min，使其充分需解，于4000 r/min离
8、心10min，取上清液10mL，备用。如上清液不足10mL，则用饱和硫酸镀补足，取洁净玻璃层析柱，在底部填少许玻璃棉并压紧，依次填装10g无水硫酸铀、2g硅藻土。称取5 g硅藻土Extrelut20与上述试样上清被搅拌均匀后，装人层析柱中。用70mL正己烧淋洗，控制流速为2mL/min，弃去正己烧淋洗液用70mL乙酸乙醋洗脱丙烯酷股，控制流速为2mL/min，收集乙酸乙醋洗脱溶液，并在45水浴中减压旋转蒸发至近干，用乙酸乙醋洗涤蒸发瓶残渣三次（每次1 mL），并将其转移至已加入1mL 0.1%甲酸榕液的试管中，祸旋振荡。在氯气流下吹去上层有机相后，加入1mL正己烧，涡旋振荡，于3500 r/m
9、in离心5min，取下层水相经0.22m水相滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。5.1.2.2 固相萃取柱净化选择2）：在试样提取的上清液中加人5mL正己蝶，振荡萃取10min，于10 000 r/min离心5min，除去有机相，再用5mL正己烧重复萃取一次，迅速取水相6mL经0.45m 水相滤膜过滤，待进行HLB固相萃取柱净化处理。HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲障、3mL 水活化，取上述滤液5mL上HLB固相萃取柱，收集流出液，并用4mL 80%的甲蹲水溶液洗脱，收集全部洗脱液，并与流出液合并待进行BondElut-Accucat固相萃取柱净化；BondElut-Accucat固相萃取柱
10、依次用3mL甲蹲、3mL水活化后，将HLB固相萃取柱净化的全部洗脱液上样，在重力作用下流出，收集全部流出液，在氯气流下将流出液浓缩至近干，用0.1%甲酸溶液定容至1.0mL，待LC-MS/MS测定。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱条件色谱柱为AtlantisC1a柱（5m、2.1mm l.D. 150 mm）或等效柱。预柱：C1a保护柱（5m、2.1mm I.D. 30 mm）或等效柱。流动相z甲蹲：0.1%甲酸(10: 90，体积分数。流速：0.2mL/min 进样体积：25L. 柱温：265.2.2 质谱参鼓5.2.2.1 三重四极串联质谱仪检测方式z多反应离子监测（MRM）。电离方式
11、z阳离子电喷雾电离源（ESI）。毛细管电压：3500 V。锥孔电压：40v。射频透镜1电压：30.8 v. 离子源温度：80。脱搭剂气温度：300。离子碰撞能量：6eV. 丙烯酷胶z母离子m/z72、子离子m/z町、子离子m/z44. iaca丙烯酷胶z母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z45. 定量离子z丙烯酷胶为m/z55 ,13C3丙烯酷腊为m/z58. 5.2.2.2 离子阱串联质谱仪检测方式z选择反应离子监测（SRM）。3 GB 5009.204-2014 电离方式z阳离子电喷雾电离源（ES！）。喷雾电压：5000 V。加热毛细管温度：300。辅气：Nz,40 Arb.
12、辅助气：N2,20 Arb. 碰撞诱导解离（CID):lOV.碰撞能量：40v. 丙烯酷胶z母离子m/z72、子离子m/z55、子离子m/z44. iaca丙烯酷胶z母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z450 定量离子z丙烯酷肢为m/z55,nCa丙烯酷脏为m/z58. 5.3 标准曲线的绘制将标准系列工作液分别注入液相色谱质谱质谱系统，测定相应的丙烯酷腊及其内标的峰面积，以各标准系列工作液的丙烯酷股进样浓度（g/L）为横坐标，以丙烯酿胶（m/z55）和13Ca丙烯酷胶内标(m/z 58）的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。5.4 试样瘪攘的测定将试样溶液注人液相色谱质谱质谱系统中，
13、测得丙烯黠胶（m/z55）和13c3丙烯酷胶内标(m/z 58）的峰面积比，根据标准曲线得到待测液中丙烯酷腹进样浓度（g/L），平行测定次数不少于两次。5.5 质谱分析分别将试样和标准系列工作液注入液相色谱贯谱质谱仪中，记录总离子流固和质谱图（见附录A中图A.1、图A.2）及丙烯耽腊和内标的峰面积，以保留时间及碎片离子的丰度定性，要求所检测的丙烯酷肢色谱峰信噪比（S/N）大于3，撞测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致，同时被测试样中目标化合物的相应监测离子丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表1.表1定性副定时相对离子车度的最大允许偏差相对离
14、子丰度允许的相对偏差基线峰的%(RSD) SO% 土20%20% 50% 土25%10% 20% 士30%-0 :J II MSG”“i 走5自主I fp-01 j ; 吼：1.18E5100 :J J m/; 1545斗555F: :J f I MS Gcn . i ”斗I lpOI -I -J冉一一告一，J飞4吨J6 .4 6.5 6.6 6.7 6.8 6且7.07.1 72 7.3 7.4 715 7.6 ti min 说明g从上至下依次为总离子流图、丙烯酷胶衍生物m/z150及13Ca丙烯酷胶衍生物m/zl55的质量色谱图圄A.4薯片样晶的GC-MS质量色谱圄（四纽杆）10 喇 立O
15、NgNmoom阁。国华人民共和国家标准食晶安全国家标准食品中丙烯酶朦的测定GB 5009.204-2014 中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号。00029)北京市西城区三里柯北街16号(100045)网址总编室，（010)68533533发行中心，（010)51780238读者服务部：（010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本88012301/16 印张1字数22千字2015年3月第一版2015年3月第一次印刷” 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话：（010)68510107书号：155066 1 51128定价GB 5009.204-2014 打印日期：2015年4月7日F002
