1、前言本标准代替GB5040 1985柑桔苗木产地检疫规程。本标准与前版标准相比有如下变化GB 5040-2003 修订后的标准在检疫性有寄生物中增加了1995年农业部新公布的检疫对象；在有害生物的检测方法、防疫措施、药剂控制、田间鉴别等方面，增加了一些新的内容与技术；引进了国际植物检疫措施标准中关于无疫产地及非疫产地生产点理念，名词术语和概念与有关国际标准保持一致。同时，对前版标准部分条文中的一些提法做了适当修改。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部种植业管理司归口。本标准主要起草单位2全国农业技术推广服务中心本标准参加起草单位z农业部
2、柑桔苗木检测中心、四川省植物检疫站、湖北省植物检疫站、浙江省植物检疫站、四川省资中县植保植检站。本标准主要起草人赵守歧、雷慧德、刘元明、林云彪、赵兰鸽、张碧兰。本标准委托全国农业技术推广服务中心负责解释。本标准1985年首次发布，本次为第一次修订。GB 5040-2003 柑桔苗木产地检瘟规程1 范围本标准规定了柑桔茵木产地的检疫性有害生物种类、苗木培育、现场检验、室内检验、检验结果报告、疫情处理及签证等。本标准适用于实施柑桔产地检疫的植物检疫机构和所有柑桔种苗繁育单位（个人）。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 产地因植物检疫的目的而单独管理的生产点。2. 2 产地检疫植物检
3、疫机构在原产地生产过程中的全部检疫工作，包括田间调查、室内检验、签发证书及监督生产单位做好选地、选种和疫情处理工作。2. 3 有害生物任何对植物或植物产品有害的植物、动物或病原物的种、株（品系或生物型。2. 4 雄!l性有寄生物对受其威胁的地区具有潜在经济重要性、但尚未在该地区发生，或虽已发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。3 检瘦性有事生物柑桔黄龙病菌Liberobacter asianticum (Citrus Huanglongbing) 柑桔溃荡病菌Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye 柑桔大实蝇Bactrocera ( Tetr
4、adacus) minax Enderlein 蜜柑大实蝇Bactrocera ( Tetradacus) tsuneonis (Miyake) 柑桔小实蝇Bactrocera dorsal is (Hendel) 4 无检疫性有害生物苗木的培育4. 1 撞疫申报柑桔苗木的繁育单位或个人，必须填交产地检疫申报表（见表），经当地植物检疫机构审核同意后方可进行繁育。GB 5040-2003 表1产地检疫申报表申报号2作物名称g申报单位（农户h联系人z联系电话g地址g种植地点种植地块种植面积品种种苗来源预汁播期预计种苗数编号667 m气亩量kg（株合计植物检疫机构审核意见：审核人2植物检疫专用章年月
5、日注1丰表一式二联，第一联由审核机关留存，第二联交申报单位。注2本表仅供当季使用。4. 2 苗圃地的选定4. 2. 1 选在无检疫性有害生物地区。4. 2. 2 在柑桔黄龙病发生区，苗圃地要符合下列条件之，a) 在平原地区，周围3km以上元柑桔类植物gb) 在山区、大河、湖泊等有自然屏障的地区，周围1.5 km以上无柑桔类植物，c) 在具有防虫网的室内封闭式育苗，防虫网迸出口具有缓冲隔离间。4. 2. 3 在柑桔溃殇病发生区，苗圃地周围1km以内无柑桔类植物。4.3 繁殖材料的采集和消毒消毒技术见附录A。4. 4 苗圃母本圄的建立消毒技术见附录B.4. 5 苗圃防疫措施4. 5. 1 禁止携带
6、未经消毒的柑桔种子、苗木和果实进入苗圃。隔离条件4. 5. 2 苗圃内使用的工具要新置专用，使用后要用10%漂白粉水溶液或1%次氯酸锅溶液消毒，用清水冲洗后晾于备用。4.5.3 严格防除柑桔木虱。4.5.4 凡外出到别的苗圃或柑桔园归返人员进入苗圃前，要换穿备用工作服、鞋帽。5 现场检验5. 1 由植物检疫人员在苗木夏梢转绿后、秋梢转绿后和出圃前进行产地检查。对苗圃周围柑桔园的姐果和苗圃内挖到的虫蝠要仔细检查，必要时应待虫蜗羽化后再进行室内鉴定。5. 2 在全国目测检查的基础上，用随机取样法检查（取样10个以上）。苗术在1万株以下查全部，1万株至10万株查30%,10万株以上查15%。5. 3
7、 记录检查结果，详细填写产地检疫田间调查记录表（见表2）。GB 5040-2003 襄2柑桔菌木产地撞田间调查记录襄调查日期接穗来源育苗单位繁育地点耐术品种接穗品种育苗时间苗本数量消毒方法隔离条件黄龙病调查株数可疑株数溃痛病田间调查情况（检疫性有害生物发生情况）调查人5. 4 柑桔苗术调运时，100株以下全部检查；10 000株以下抽样检查6%10%;10 000株以上抽样检查3%5%。6 重内撞瞌6. 1 发现有检疫性有害生物的可疑样本，现场又难以确切诊断的，应将被害苗木、病残体或害虫标样及时送回实验（检验）室确诊鉴定。6. 2 柑桔检疫性有害生物识别鉴定见附录c.7 撞验结果由植物检疫实验
8、（检验）室对送检样品进行检验后，应出具检疫检验报告单见表3）。表3检疲检验报告单对应申报号样本编号取样日期植物名称品种名称取样部位检验方法捡验结果备注检验人签名审核人（签名）单位盖章年月日GB 5040-2003 8 瘦情处理8. 1 发现检疫性有害生物，由植物检疫机构签发植物检疫处理通知书以表4），通知管理人进行处理，并派人监督执行。表4植物检瘦处理通知书捡）字第号单位联系人联系电话植物名称种植地点种植面职种茵数量kg（株）检验结果处理意见检疫员签字站长（签字）植物检疫站盖章年月日注E第一联交申报单位（人）第二联留植物检疫机关。8. 2 发现柑桔黄龙病病株，应立即挖除烧毁，并喷药防治苗圃及其
9、周围的柑桔木虱。8. 3 发现柑桔溃殇病病株，应立即挖除烧毁，对周围苗圃连续23年在春梢、秋梢萌发期监测，并选用可杀得、叶青双等杀菌剂喷药保护。8. 4 严格禁止柑桔大实蝇、蜜柑大实蝇、柑桔小实蝇发生区内的苗木外运。9 签证经田间产地检疫和必要的室内检验，未发现柑桔黄龙病、柑桔溃殇病、柑核大实蝇、蜜柑大实蝇、柑桔小实蝇的苗木、枝条可签发产地检疫合格证机见表日，此证只证明该批苗木接穗不带本规程规定的检疫性有害生物，调运时，需要根据调入地检疫要求确定是否进一步检疫或直接签发检疫证书。GB 5040-2003 襄5产地被瘦合格证有效期至年月日检疫日期年月日( 检（）字第号作物名称品种名称种植面积田块
10、数目种苗数量kg（株种苗来源种植单位负责人检疫结果签发机关（盖章检疫员注1，丰证第一联交生产单位凭证换取植物检疫证书，第二联留存检疫机关备查注2，本证不作植物检疫证书使用GB 5040-2003 附录A规范性附录）繁殖材料的采集和消毒技术A.1 种子消毒A. 1. 1 器材超级恒温器，1台；水桶，1个，保温茶桶1个煮水锅，1个p种子铁网笼（或纱网袋），个，标准温度计，I支s普通温度计，I支。A. 1. 2 消毒步骤A. 1.2. 1 在恒温器内注入5556热水，并使之自动控制在55士o.3之内，若用保温茶桶注人水温略高一点的热水，使桶内水温达到5557（不高于57）；A. 1. 2. 2 柑桔
11、种子用铁网或纱网袋装好，置于5052热水中预浸5min 6 mm; A. 1. 2. 3 取出立即投入恒温器或保温茶桶内，投入种子后注意并记录水温变化，使水温保持在55士0.3之内处理50min; A. 1. 2. 4 处理完毕取出立即摊开冷却，稍晾于，即可播种或贮藏。A. 1. 3 其他凡接触己消毒种子的人员必须先用肥皂洗手，盛种子器皿不带柑桔溃荡病菌。A.2 接穗采集和消毒A.2.1 采集接穗采白无病区、病区内隔离健康老树和6年生以上无病果园中的健康植株。A. 2. 2 消毒A. 2.2. 1 器材水桶，l个；水盘，l个事消毒用塑料盘（或桶)4个g方盘2个s放大镜3个s500 mL量筒（或
12、量杯）I 个；四环素若干g链霉素若干g酒精适量；草纸适量。A. 2. 2. 2 1肖毒步骤A.2.2.2. 1 用放大镜逐条检查接穗，淘汰带病虫芽条sA. 2. 2. 2. 2 配I000单位mL盐酸四环素液备用；A. 2. 2. 2. 3 把接穗置于四环素液中浸2h，浸溃过程中需经常捣动接穗，驱除按穗切口、叶痕和芽眼上的气泡，浸溃后用清水冲洗，然后取出转入A.2. 2. 2. 4; A. 2. 2. 2. 4 在700单位mL硫酸链霉素和1%乙醇的混合液中浸30min，取出静置20min 30 min, 清水冲洗，摊开，晾干表面水分，用清洁草纸包装保湿贮藏或嫁接。A.2.3 其他凡需接触消毒
13、后接穗的人员，必须先用肥皂水洗手，包装材料不带柑桔攒殇病菌。GB 5040-2003 附录B（规范性附录）母本因接穗消毒技术B.1 器材恒温接穗消毒箱或超级恒温器，1台；水桶，1个，链霉素，200万单位$量筒（500mL), 1个s标准温度计，1只g普通温度计，1只，清洁草纸；纱布g放大镜，3个。B.2 消毒步骤B.2.1 用放大镜仔细检查接穗，除去带病斑的芽条B.2.2 消毒箱加温（水浴加温），使箱内湿热空气达49C，并保持49土0.3。B.2.3把接穗倒置放人消毒箱内，迅速加盖，待温度回升至49时，开始计算处理时间，保持49士。.3，并维持50min, B. 2. 4 处理完毕，把接穗立即
14、取出，转人3840含1%乙醇的700单位mL链霉素溶液中（即每100 mL链霉素加人lmL乙醇），浸30min, B.2.5 取出后在洁净的器皿上放置20min 30 min，冲洗，表团水分晾干后用纱布保存待用。GB 5040-2003 c. 1 柑桔溃荡病c. 1. 1 症状检查附录C规范性附录柑桔检瘟性有害生物识别鉴定c. 1. 1. 1 叶片症状病斑初时针头大、黄白色、泊渍状，扩大后叶片病斑两面隆起，中心破裂，呈海绵状，灰白色，后来病部木栓化，表面粗糙，呈灰褐色火山口状开裂。病斑多近圆形，坏死区外可见圈，周围有黄色晕环，老叶上病斑的黄色晕环有时不明显。C.1.1.2 枝条症状z病斑近圆形
15、，灰褐色表面粗糙、突起、无黄色晕环，几个病斑常连成不规则的斑块于燥情况下，溃荡病斑海绵状、木栓化，隆起、表面破裂s表面完整，边缘油渍状。抗性品种在病健交界处形成愈伤组织层，通过用刀切去外部软木塞状物质而留下粗糙表面，可以确认为溃殇病。c. 1. 2 病理解剖选取新鲜幼小病斑，从病健交界处徒手切成薄片滴一滴蒸馆水进行镜检，若有呈雾状菌浓溢出，见到组织细胞溃烂，形成空腔，病健部组织之间元离层，可确定为溃殇病。c. 1.3 分离c. 1. 3. 1 取小块病组织用无菌水冲洗后放入o.5 mL 2. 0 mL无菌水，用灭菌玻棒研碎，在室温下浸泡15min 20 min，将抽提液在营养琼脂培养基上划线分
16、离。在看不J症状的情况下，用无菌水洗涤叶片(10片以上），离心浓缩后做适当稀释，在28C人工培养基上（20个培养皿以上划线）培养，挑取单菌落。c. 1. 3. 2 适宜的分离培养基为l:lPG（牛肉浸膏3.0 g，蛋白陈5.0 g，葡萄糖2.5 g，琼脂16.0 g). c. 1. 3. 3 柑桔溃荡病菌培养基上，菌落圆形，黄色，有光泽，全缘，稍隆起，粘稠。菌体短杆状，常连成链状，大小为（0.5 0. 7) mX (1. 5 2. O) m，两端圆，极生单鞭毛，能运动，有英膜，无芽抱，革兰氏染色阴性。c. 1. 4 离体叶片富集采集温室中生长的感病品种柑桔茵的幼顶叶，用自来水冲洗10min.1
17、%次氯酸俐溶液表面消毒I min 4 min，在无菌条件下用灭菌蒸馆水彻底冲洗，然后针刺叶片背面造成伤口，背面朝上放于盛有1%水洋菜的培养皿中，每个伤口（5个10个针眼）加JOL 20 L病斑水拙提液，在25C30有光条件下培养5天7天后，观察针刺伤口的反应，通常一周内形成典型的组织进裂症状如果需要做菌原分离，方法同上。c. 1. 5 血清学检验c. 1. 5. 1 抗血清制备：由经检疫机构确认的单位统一提供标准抗血清。c. 1. 5. 2 酶联检测（ELISA），由经检疫机构确认的单位提供诊断试剂盒，按统一方法检测。c. 1. 5. 3 免疫荧光测定OF），由经检疫机构确认的单位提供诊断试剂
18、盒，按统一方法检测。c. 1. 6 致病性鉴定用分离培养得到的可疑菌或血清学鉴定阳性菌株，接种感病柑桔的苗木，最终鉴定柑桔溃荡病。C.2 柑桔黄龙病C.2.1 主要诊断依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化”和“黄梢”。叶片斑驳型黄化即叶片转绿后从主、伽l脉附近和叶片基部开始黄化，黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳，后来可以全叶黄化。黄梢即在发病初期绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化。C.2.2 田间症状难以确诊的，可采集样本送检疫实验（检验）室，运用PCR技术进行检测。GB 5040-2003 c. 3 柑桔大实蝇c. 3. 1 用肉眼或低倍放大镜检查柑桔苗圃周围桔园果实外部有无产卵孔、幼虫脱果孔
19、。c. 3. 1. 1 产卵孔：因品种不同，表现症状各不相同。甜橙z产卵孔多在果腰或腰脐之间其周围果皮呈乳状凸起，凸起部分果皮汹胞细密，光滑，子触顶手g中央内缩下陷呈黑色小孔，四周有木栓化白色放射状裂纹；被害果产卵孔附近有未熟先黄，黄中带红的现象。红桔z产卵孔多在脐部，但也有在果腰的。产卵孔周围果皮不凹陷，微凸，呈一小黑点，手触微有顶手感，有未熟先黄现象。拧攘g产卵孔多在果腰部，其周围果皮微凸，有一个小黑点，手触微顶手感。果实未见未熟先黄现象。袍子产卵孔多在蒂部，其周围果皮向内呈圆形或长椭圆形凹陷，中央内结呈暗色深孔个别有木栓化灰白色小裂纹。未熟先黄现象不明显。注意与蟠象为害及机械刺伤的区别。
20、蟠象危害及机械刺伤刺点不突出，也不凹陷，横剖白皮层元晕圈，瓢瓣完整。C. 3. 1. 2 脱果孔z于L内大外小，深达瓢瓣，外缘整齐光滑（注意与吸果夜峨成虫刺孔的区别z吸果夜娥刺孔内外大小一致，边缘多数整齐，有时有汁液溢出。与卷叶峨幼虫蛙孔的区别z卷叶娥幼虫蛇孔外大内小，一般只达白皮层，边缘呈啃齿状，有时有白色丝状物）。C.3.2幼虫z体长15mm 17 mm，圆锥形，前小后大，乳白色光亮。前气门扇形，前缘中间下凹，有30个左右的指突（注意与蜜柑大实蝇幼虫的区别。蜜柑大实蝇幼虫前气门“T”字形，两边略弯曲，有33个35个指突，与小实蝇的区别在于小实蝇的幼虫前气门呈环柱形，有10个13个指突），后
21、气门肾脏形，气门板上有3个长椭圆形裂口，外侧有4丛细毛群（外露气管丛），内侧中间1个扣状突（蜜柑大实蝇有5丛细毛群，柑桔小实蝇后气门新月形，外面H丛细毛群特多，内侧扣状突较大而明显）。c. 3. 3 成虫2体长12mm 13 mm（不包括产卵器），翅展20mm 24 mm，黄褐色。胸部背面具鲜黄色和黑褐色条纹，常在正中构成“人”字形纹。胸部具有肩板侧鬓1对，背侧鬓前后各1对，后翅上鬓2对，小盾鬓1对。腹部卵圈形，背面中央有一黑色纵纹与第3腹节前缘黑色横纹交又成“卡”字形纹。雌虫背面可见5节，产卵器3节，基节膨大，与腹部等长，后2节狭小，但长于腹部第5节（蜜柑大实蝇产卵器基节长度为腹部之半，后2
22、节短于腹部第5节）。雄虫背面可见6节，末节短小。c. 3. 4 蜗g蜗长Smm10mm，圆筒形，黄褐色，幼虫前后气门遗痕依然存在。C.4 富柑大实蝇c. 4. 1 成虫z长10mm 12 mm，与柑桔大实蝇极相似，不同之处在于具前翅上鬓1对2对肩板鬓常2对，中对较粗、发达、黑色。产卵器基节长仅为腹长之半，其后方狭小部分短于第5腹节。C.4.2幼虫2前气门宽阔，呈“T”字形，外缘较平直，微曲，有指突33个35个，后气门裂口周围有细毛群5丛（2、3龄幼虫）。C.4.3 蜗：蜗体长8.0mm 9.8 mm，宽3.8mm 4. 5 mm，椭圆形，黄褐色至淡黄色。C.5 柑桔小实蝇C.5. 1 成虫z长7mmSmm，带深黑色，胸背具小盾前鬓1对。腹部较粗短，背面中央黑色纵纹仅限于第3节第5节上。产卵器较短小。c. 5. 2 幼虫E前气门较窄小，略呈环柱形，前缘有指突10个13个，排列成行。后气门新月形，具3个长形裂口，其外侧有4丛细毛，每丛细毛特多。C.5.3 蜗z蜗椭圆形，长5mm，宽2.5 mm，淡黄色，前端有前气门残留的突起，后端后气门处稍收缩。
