1、GB/T 174071998 前 言 本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册 （AOAC） 分定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系 统研究而制定出来的。本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究 所负责起草； 青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。 本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。 本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国国家标准 食品中维生素 B6的测定 Determination of vitamin B6in foods GB/T 17407
2、1998 1 范围 本标准规定了用微生物法测定食品中维生素 B6的含量。 本标准适用于各类仪器中维生素 B6的测定。 2 原理 卡尔斯伯（Sacharomyces Xarlsbrgensis）酵母菌需在有维生素 B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素 B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与 标准曲线相比较得出样品中维生素 B6的含量。本方法检出限为 0.1 g。 3 试剂和培养基 本实验所用水均为蒸馏水。所用的试剂均需分析纯。 3 1 0.22 mol/L 硫酸溶液； 取 12.3 mL 相对密度为 1.84 的硫酸加水知释至 1000 mL。 32 4
3、mol/L、1 mol/L 及 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液。 33 25%（V/V）乙醇溶液。 3 4 维生素 B6标准中间液 （1.0 g/mL） ： 精 确称取 0.1220 g 经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用 25%乙醇定容至 1000 mL，冰箱中保存。 3 5 维生素 B6标准中间液 （1.0 g/mL） ： 吸 取 5.00 mL 维生素 B6标准储备液于 500 mL 容量瓶中，用 25%乙醇定容至 1000 mL。冰箱中保存。 36 维生素 B6标准应用液（50 ng/mL） ：临用时吸取 5.00 维生素 B6标准中间液于 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容。 37
4、 琼脂 38 吡哆醇 Y 培养基（Pyridoxine Y medium Difco 0951-15-2） ：称取 5.3 g吡哆醇 Y 培养基，用水稀释至 100 mL。用时现配。 中华人民共和国卫生部 19980505 批准 199 90101 实施 中华人民共和国卫生部GB/T 174071998 39 琼脂培养基：称取 5.3 g 吡哆醇 Y 培养基、1.2 g 琼脂于烧杯中，加入维生素 B6标准中间液 2 mL（3.5） ，加水至 100 mL，于水浴中加热溶解，真热尽快分装入试管中，每管 35 mL，塞上棉塞，于 121高压灭菌 5 min。制成的斜面培养基，于 4冰箱内保存。 3
5、10 生理盐水：称取 0.9 g 氯化钠 溶解于 100 mL 水中。每次使用前，分别倒入 24 支 15 mL 试管中，每支约 10 mL，塞上棉塞于 121高压灭菌 5 min，备用。 3 11 0.04%溴甲酚绿溶液： 称取0.1 g溴甲酚绿于小研钵中， 加1.4 mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至守全溶解，用水稀释至 250 mL。 4 仪器和设备 41 实验室常用设备。 42 电热恒温培养箱。 43 压力蒸消毒锅。 44 液体快速混合器。 45 离心机。 46 分光光度计。 47 耐热硬质玻璃试管：12 mm(i.d)160 mm。 5 菌种与培养液的制备及
6、保存 51 储备菌种 的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种 (Saccharomyces Carlsbrgensis 中科院微生物所 No. AS：2.1419)接入 23 支琼脂培养基管中，在 30恒温箱中培养 1820 h， 取出，于冰箱中保存不超守两周。保存数周以上的储备菌种， 不能立即做制备接种液用， 必须在使用前每天移种一次， 连续 23 次，才可使用。 52 种子培养液的制备：5 mL 吡哆醇 Y 培养基及维生素 B6标准应用液 0.2 Ml（3.6 ）于试管中塞上棉塞，于 121 高压灭菌 5 min，放冷，于冰箱中保存。每次制备 24 管备用。 6 操作步骤 61 种子液的制备：需无
7、 菌操作。用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母转种到种子培养液（5.2）中塞上棉塞，以 45倾斜度于 30温度下培养 1820 h，在 1500 r/min 下离心 510 min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水 5 mL 稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。 62 样品提取液的制备 称取样品 0.510 g（维生素 B6含量不超过 10 ng）放入 100 mL 三角瓶中，加 72 mL0.22 mol/L 硫酸溶液，用瓷坩 埚盖于瓶口，于 121高压水解样品 5 h，取出冷却后，加约 10 mL 4 mol/L 氢氧化钠，以溴甲酚绿作外指示剂，高节 pH值至 4
8、.5 （指示剂由蓝绿色变为黄绿色） 。 将三角瓶内容物移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 用滤纸过滤后， 滤液于冰箱中保存备用 （保存期不宜超过 36 h） 。 63 样品试液管的制备 每支试管中分别加入0.05,0.10 ,0.20 mL的样品提取液， 每个样品需做两组，再加入 5 mL 吡哆醇 Y 培养基。 64 标准系列管的制备 每支试管中分别加入维生素 B6标准应用液 0,0.02,0.04,0. 08,0.12,0.16 mL（相当于维生素 B60,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0 ng），然后各加入 5 mL 吡哆醇 Y 培养基。 中华人民共和国卫生部 19980
9、505 批准 199 90101 实施 GB/T 174071998 65 灭菌 样品管（6.3）和标准管（6.4）混均后，塞上棉塞，于 121高压灭菌 5min。 6.6 接种和培养 待试管冷至室温后， 在无菌条件下操作， 用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于 30温箱内培养 1820 h。 67 测定 将培养后的标准系列管和样品管， 在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。用分光光度计于 550 nm 波 长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。 7 计算 以标准系列的含量 （ng） 为横坐标， 以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标， 绘制标准曲线。 用样品 的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素 B6含量，再折算成每毫升样品中维生素 B6含量。 610100=mVcX （1） （2） 3/)(321uuuc +=式中： X样品中维生素 B6的含量，mg/100 g； c样品提取液中维生素 B6的浓度，ng/mL； u各样品测定管中维生素 B6的浓度，ng/mL； V样品提取液的定容总体积，mL； m样品质量，g； 100/106折算成每 100 g 样品中维生素 B6毫克数。 8 结果的重复性 同一实验室同时或连续 2 次测定结果相对偏差绝对值 10%。 中华人民共和国卫生部 19980505 批准 199 90101 实施
