1、ICS 13.060.50 Z 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 20466-2006 水中微囊藻毒素的测定Determination of microcystins in water 2006-08-24发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布前本标准由中国科学院提出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国科学院水生生物研究所。本标准主要起草人z甘南琴、肖邦定、宋立荣、刘永定、陈伟。GB/T 20466-2006 GB/T 20466-2006 水中微囊藻毒素的测定范围本标准规定了高效液相色谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定水中微
2、囊藻毒素(环状七肤)的条件和详细分析步骤。本标准适用于饮用水、湖泊水、河水、地表在且战囊藻毒素的测定。样品中微囊藻毒素的检出7颇有色谱法和酶联联吱法均为o.1吨/L。2 微囊藻毒素的分子式、分2.1 分子式微囊藻毒素RR(LR(肌1C-LR):C49 2.2 分子质量MC-RR:IO挠2. 3 结构式MC-LR 3 高效液相色谱法3.1 方法提要 H72 N10 013，微囊藻毒素-R2 L-Arg L-Arg L-Arg 微囊藻毒素在波长238nm下有特异的吸收峰。不同的微囊藻毒素异构体在高效液相色谱中有不同的保留时间，与标准微囊藻毒素的保留时间相比较，可确定样品中微囊藻毒素的组成。依据出峰
3、面积，计算水样中微囊藻毒素的含量。3.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、蒸馆水或去离子水。G/T 20466-2006 3.2. 1 甲醇z色谱纯。3.2.2 20%(体积分数)甲醇溶液:20mL甲醇(3.2.1)与80mL水混合。3.2.3 50%(体积分数)甲醇溶液:50mL甲醇(3.2.1)与50mL水混合。3.2.4 磷酸二氢饵溶液(0.05mol/U:称取0.68g磷酸二氢饵，用水溶解，定容至100mL。3.2.5 20%(体积分数)磷酸溶液:20mL磷酸与80mL水混合。3.2.6 三氟乙酸(TFA):色谱纯。3.2.7 磷酸盐缓冲榕液:用20%(体积分数)磷酸榕液(3
4、.2.5)将磷酸二氢饵溶液(3.2.4)调至pH3.0。3.2.8 淋洗溶液:10mL水;10mL 20%(体积分数)甲醇溶液(3.2.2)。3.2.9 洗脱溶液(酸化甲醇恪液):用甲醇(3.2.1)将0.1mL三氟乙酸(3.2.6)定容至100mL。3.2. 10 微囊藻毒素标准品:微囊藻毒素LR(MC-LR)、微囊藻毒素-RR(MC-RR)、微囊藻毒素-YR(MC-Y邸，纯度不低于95%。3.2. 11 微囊藻毒素标准储备液:分别称取微囊穰毒素标准品(3.2.10) MC-LR、MC-RR、MC-YR各0.5 mg(按实际含量折算)，用500L甲醇(3.2.1)榕解，再用纯水定容至50mL
5、，一20.C保存。此标准储备溶液的浓度约为10吨/mLo3.2.12 标准系列洛液:用20%(体积分数)甲醇(3.2.2)将微囊藻毒素标准储备溶液(3.2.11)分别稀释至约0.00g/mL、o.1g/mL、o.2g/mL、o.5g/mL、1g/mL、2g/mL、5g/mL、10g/mLC临用时配制)。3.3 仪器和设备3.3. 1 不锈钢筛:500目。3.3.2 不锈钢或玻璃杯式滤器:250mL。3.3.3 抽滤瓶:带真空泵。3.3.4 滤膜:GF/C玻璃纤维滤膜和0.45m乙酸纤维醋滤膜。3.3.5 C18固相萃取小柱:Sep-pak柱，500 mg/6 mL。3.3.6 50 mL玻璃注
6、射器、100mL玻璃注射器或SPE固相萃取装置。3.3.7 旋转蒸发器或吹氮浓缩器。3.3.8 涡旋混合器。3.3.9 高效液相色谱仪:配有紫外可见光检测器。3.3. 10 色谱柱:C18反相柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料粒经5mo3.4 分析步骤3.4.1 水样的采集和保存用采水器采集1500 mL2 000 mL水样(水样采集后，应在4h内完成以下前处理步骤)。用500目的不锈钢筛(3.3. 1)过滤，除去水样中大部分浮游生物和悬浮物。取过滤后的水样1200 mL于玻璃杯式滤器(3.3.2)中，依次经滤膜(3.3.4)减压过滤。准确量取1000 mL滤液置于棕色试剂瓶中。注:如减
7、压过滤后的水样不能立即分析，可置于玻璃容器中，在一20C保存，30d内分析完毕。3.4.2 水样的富集和洗脱3.4.2. 1 C18固相萃取小柱(3.3.5)预活化用玻璃注射器吸取10mL甲醇(3.2.口，注入Cl8固相萃取小柱(自然滴下)。当甲醇液面接近小柱上层筛片时，加人10mL15 mL纯水活化(活化过程，不应使C18固相萃取小柱变干，萃取小柱中应始终充满液体)。连接50mL或100mL玻璃注射器，或连接SPE固相萃取装置(3.3.6)。3.4.2.2 微囊藻毒素的富集和洗脱将1000 mL 水样滤液(3.4.1)依次注入50mL玻璃注射器、100mL玻璃注射器或SPE固相萃取装置(3.
8、3.6)中，使水样滤液流经预先活化的Cl8固相萃取小柱(3.4. 2. 1)进行富集(控制流速为8 mL/min 10 mL/min)。富集完毕，依次用淋洗榕液(3.2.8)淋洗Cl8固相萃取小柱。再用10mL洗GB/T 20466一2006脱榕液(3.2.9)洗脱微囊藻毒素(萃取过程，不应使C18固相萃取小柱变干，萃取小柱中应始终充满液体)。洗脱液收集在玻璃容器中。保留富集后的水样，用于再次富集。3.4.2.3 再次富集和洗脱按3.4.2.2的操作步骤，再次富集、洗脱。注2有条件的实验室可选择较大柱容量的C18固相萃取小柱，只需对水样富集、洗脱一次。3.4.3 定睿将两次洗脱液混合，在400
9、C下用旋转蒸发器或吹氮浓缩器(3.3.7)浓缩至干。用1mL甲醇(3.2. 1)分两次(第一次、第二次各O.5时_)溶解浓缩至干的物质，用涡旋混合器(3.3.8)充分涡旋?昆合1 min。用尖嘴吸管取出，小股氮气流吹干(或离心干燥)，加50%(体积分数)甲醇溶液(3.2.3)定容至100L。此步骤均应在玻璃容器中操作。3.4.4 测定3.4.4.1 色谱条件一一色谱柱温度:40oC; 流动相:甲醇(3.2.1)与磷酸盐缓冲溶液(3.2.7)按体积比(57 : 43)混合;流速:1mL/min; 检测器:紫外可见光检测器波长238nm。3.4.4.2 定量用进样器分别吸取10L标准系列溶液(3.
10、2.12)，注入高效液相色谱仪(3.3.的。在上述色谱条件。.4.4.1)下测定标准系列溶液的响应峰面积。以响应峰面积为纵坐标，标准系列溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。吸取10L试样(3.4.盯住入液相色谱仪，在上述色谱条件(3.4.4.1)下测定试样的响应峰面积(应在仪器检测的线性范围内)。依据测定的响应峰面积，在标准曲线上查出(或用回归方程计算出)水样中微囊藻毒素的含量。在上述色谱条件(3.4.4.1)下，MC-RR、MC-YR、MC-LR的保留时间分别约为8.8min、9.5min、10.6 min 在上述色谱条件(3.4.4.1)下，标样及水样中微囊藻毒素的色谱图见图1
11、和图2。时闽、时，2国2国时，20.014 0.012 0.010 。onOAVAU nunu nUA 33Mm棋昏0.004 0.002 0.000 3 自l1n12.00 10.00 微囊藻毒素(MC-RR、MC-YR、MC-LR)标样色谱固8.00 6.00 4.00 2.00 圄1GB/T 20466-2006 0. 080 0.070 0.060 0.050 2 0.040 赵母司董哥0.030 0. 020 4 间接竞争酶联免症吸4. 1 方法提要20. 00 口1Inu.仙(1 ) 水中的微囊藻毒素经离心或过撼扯理后与一定量的特异性如伴吱应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结
12、合。加入酶标记物和底物显咆阳且矗盗藻毒、比较，计算水样中微囊藻毒素的含量。4.2 试荆除非另有规定，仅使用分析纯试剂、蒸馆水或去离子水。4.2.1 抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体:杂交瘤技术制备，经亲和层析纯化。4.2. 2 人工抗原:MC-LR-牛血清白蛋白结合物(MC-LR-BSA)。4. 2.3 20%(体积分数)乙醇溶液:20mL乙醇与80mL水混合。4. 2.4 标准稀释液:称取0.005g明胶和O.1 g叠氮化销，用水溶解，定容至100mL。4.2.5 微囊藻毒素(MC-LR)标准系列溶液:称取适量微囊藻毒素(MC-LR)标准品(3.2.10)，用20%(体积分数)乙醇溶液
13、(4.2.3)配制成MC-LR含量为0.5mg/mL的榕液。再用标准稀释液(4.2.4)稀GB/T 20466-2006 释至MC-LR含量为10g/mL的溶液。继续配制MC-LR含量分别为o.1g/L、o.2g/L、O.5g/L、1g/L、2g/L的标准系列榕液。4.2.6 牛血清白蛋白CBSA):生化试剂。4.2.7 酶标二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG。4.2.8磷酸盐缓冲溶液(pH7.4):分别称取O.2 g磷酸氢二饵、2.9 g磷酸氢二铀(Na2 HP04 12H20)、8.0g氯化锅、0.2g氯化饵，混合，用水溶解，定容至1000 mL。4. 2.9 乙酸铀溶液(
14、0.1 mol/U:称取1.36 g三水合乙酸俐，用水溶解，定容至100mL。4.2. 10 乙酸榕液(1mol/L):量取5.88mL冰乙酸，加水定容至100mL。4.2. 12 4.2.13 4.2.14 4.2.15 4.2.16 4.2. 17 4.2.18 4.3. 1 4.3.2 4. 3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.4 分析步骤4.4. 1 水样的采集和4. 4. 1. 1 采集约5mL水，咕，中大部分浮游生物和悬浮物74.4. 1. 2 采集约5mL水样，物).取1mL滤液置于离心管中，注入约200mL水中，搅拌，冷却至室冲溶液(4.2.8)中。冷却
15、后定容至1000 mL。将包被榕液(4.2.12)加入酶标微孔板(100L/孔).40C下放置过夜。4.4.2.2 封闭酶标微孔板用洗涤液(4.2.14)洗涤3次放置过夜的酶标微孔板(每次洗涤3min).加入封闭溶液(4.2.13)封闭酶标微孔板(200L/孔).370C下放置2h.或40C下放置过夜。4.4. 2.3 抗原抗体反应以下操作同时进行。a) 量取500L抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体(4.2.1)和500L微囊藻毒素标准系列洛液(4.2.5中的O.1g/L溶液)于1.5 mL试管中.7昆合后用电动振荡器(4.3.3)振荡，室温静GB/T 20466一2006置30min。
16、按以上操作配制其余反应液。这些反应液用于制作微囊藻毒素标准抑制曲线。b) 量取500L抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体(4.2.1)和500L水样(4.4.1)于1.5 mL 试管中，混合后用电动振荡器(4.3.3)振荡，室温静置30min。此反应液用于测定水样中微囊藻毒素的含量。4.4.2.4 竞争反应用洗涤液(4.2.14)洗涤3次封闭过的酶标微孔板(每次洗涤3min)，滴加抗原抗体反应榕液(4.4.2.3)(100L/孔)。不同浓度做两次平行试验。370C或室温放置90min。在酶标微孔板的适当孔位滴加抗体稀释溶液(4.2.1日，作为阴性对照。4.4.2.5 二抗溶谊与抗微囊藻毒素
17、(MC-LR)的单克隆抗体反应用洗涤液(4.2.14)洗涤3次竞争反应后的酶标微孔板(每次洗涤3min) ，滴加二抗溶掖(4.2.16) (100L/孔)，370C或室温放置30mino 4.4.2.6 显色及显色后眼光度的确定用洗涤液(4.2.14)洗涤5次经4.4. 2. 5反应的酶标微孔板(每次洗涤3min)。滴加底物溶液(4.2.19) (100L/孔)，370C或室温放置15min 20 min，显色。滴加1mol/L硫酸(4.2. 11) (50L/孔)，终止显色反应。30 min内，用酶标仪(4.3.4)在450nm处，测定显色后的吸光度。4.4.2.7 定量取经4.4. 2.
18、6测定的标准系列溶液的吸光度平均值与水样吸光度平均值，按式(2)分别计算标准系列溶液吸光度(或水样吸光度)与阴性对照试验的比值(X2)，其数值以%表示。式中zX 门口，2-一一X 100 OD2 X2一一标准系列溶液吸光度(或水样吸光度)与阴性对照试验的比值，%;ODj-一标准系列溶液的吸光度平均值与水样吸光度平均值;OD2一一一水样吸光度平均值。( 2 ) 以X2为纵坐标，不同标准系列溶液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。依据测定水样的吸光度，在标准曲线上查出(或用回归方程计算出)样品中微囊藻毒素的含量。4.5 结果计算水样中微囊藻毒素的含量(X3)以g/L表示，按式(3)计算
19、:X3 = C2 X V2 式中zX3一一水样中微囊藻毒素的含量，单位为微克每升(g/U;C2一一从标准曲线上查出的微囊藻毒素含量，单位为微克每升(g/L); V2一-水样的稀释倍数。计算结果应表示到小数点后两位。4.6 允许差同一水样，两次平行测定结果之差，不得超过平均值的10%。5 测定结果的保证与控制每一测定批次，应使用已知量的样品做测定结果的控制试验。6 . ( 3 ) G/T 20466-2006 参考文献高效液相色谱法lJ Lawton L. A. , Edwards C. , Codd G. A. Extraction and high-performance liquid ch
20、romato graphic method for the determination of microcystins in raw and treated waters. Analyst, 1994 , 119(7): 1525-1530. 2J Ikawa M. , Phillips N. , Haney J.丑，etal. Interference by plastics additives in the HPLC determination of microcystin-LR and -YR. Toxicon, 1999 , 37(6): 923-929. 3J Ramanan 丘，T
21、ang 工，Velayudhan A. Isolation and preparative purification of microcystin variants. J Chromatogr A , 2000 ,883 (1): 103-112. 间接竞争酶联免疫吸附法lJ An J. , Carmichael W. W. Use of a colorimetric protein phosphatase inhi ition assay and en zyme linked immunosorbent assay for the study of microcystins and nodu
22、larins. Toxi.con, 1994 , 32 :1 495-1507. 2J Rivasseau C. , Racaud P. , Deguin A. , et al. Evaluation of an ELISA Kit for the Monito ring of Microcystins (Cyanobacterial Toxins) in Water and AIgae Environmental Samples. Environ. Sci. Technol. , 1999 , 33(9): 1520-1527. 3J Jarkko R. , Kirsti E. , Jaan
23、a K. , et al. Detection of Microcystins with protein phosphatase inhibition assay, high-performance liquid chromatography-UV detection and enzyme-linked immunosorbent assay comparison of methods. Analytica Chimica Acta, 2002 , 466: 213-231. CON-叮ONH阁。国华人民共和国家标准水中微囊藻毒素的测定GB/T 20466-2006 中9唔中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争峰印张o.75 字数16千字2006年12月第一次印刷开本880X1230 1/16 2006年12月第一版导定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066. 1-28595 GB/T 20466-2006
