1、GB/T 4789. 10-2003 66 前言本标准对GB/T4789. 101994食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验进行修订。本标准与GB/T4789.10-1994相比主要修改如下2-一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改.修改并规范原标准中的设备和材料。一-附录A中A.2.15试剂浓度由0.008mol/L修改为0.2mol/L. 本标准自实施之日起，GB/T4789. 10-1994同时废止。本标准的附录A是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位s北京市卫生防疫站、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人:;t
2、tJ以贤、冉陆、付薄、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订。1 范围食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789. 10-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 28-2003 食品卫
3、生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3.1 冰箱，OC4C。3.2 恒温培养箱，36C士lC。3.3 显微镜，lOX100X。3.4 均质器或灭菌乳钵。3.5 架盘药物天平，0g500 g.精确至0.5g , 3.6 灭菌试管，10mmX 100 mm、16mmX 160 mm, 3.7 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mLJ度)。3.8 灭菌锥形瓶:500mL、100mL。3.9 灭菌培养皿g直径90mm, 3.10 注射器:0.5mL。3.11 灭菌L型涂布棒。3.12 灭菌刀、剪子、镶子等。4 培养基和试剂4.1 膜酶陈大豆肉汤:按GB/T4789.
4、28-2003中4.59规定。4.2 7.5%氯化纳肉汤z按GB/T4789. 28-2003中4.61规定。4.3 血琼脂平板=按GB/T4789. 28-2003中4.6规定。4.4 Baird-Parker琼脂平板g按GB/T4789. 28-2003中4.60规定。4.5 肉浸液肉汤:按GB/T4789. 28-2003中4.1规定。4.6 0.85%灭菌生理盐水。4.7 兔血浆2按GB/T4789. 28-2003中4.63规定。5 检验程序金黄色葡萄球菌检验程序见图1.67 GB/T 4789. 10-2003 检样25 g(mL)+225 mL灭菌生理盐水固16 操作步骤6.1
5、增菌培养法6. 1. 1 检样处理z按元菌操作取检样25g(mL).加入225mL灭菌生理盐水，团体样品研磨或置均质器中制成混悬液。6.1.2 增菌及分离培养2吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化树肉汤或膜酶厉、大豆肉汤50mL 培养基内.36C士lC培养24h.转种血平板和Baird-Parker平板.36C士1C培养24h.挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。6. 1.3 形态s本菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，元英膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5m-1m。6. 1. 4 在肉汤中呈混浊生长，在膜酷陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量
6、多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2mrn,._, 3 rnm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为-混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。6. 1. 5 血浆凝固酶试验s吸取1: 4新鲜兔血浆。.5mL.放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL.振荡摇匀，置36C土1C温
7、箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h. 如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。6.2 直接计敏方法6.2.1 吸取上述1: 10混悬液，进行10倍递次稀释，根据样，品污染情况，选择不同浓度的稀释液GB/T 4789.10-2003 1 mL，分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36(;士lC1 h.等水分蒸发后反转平皿置36(;士1(;培养。6.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五
8、个菌落，分别接种血平板，36(;土lC24 h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。6.2.3 菌落计数s将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5.再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。69 GB/T 4789. 10-2003 附录A(规范性附录)葡萄球菌肠霉素检验A.1 设备和材料A. 1. 1 冰箱:0C4C。A. 1. 2 恒温培养箱:36C:l:1C。A. 1. 3 振荡培养箱或普通培养箱:36C士lC。A. 1. 4 酶标仪。A. 1. 5 离心机:8 000 r/min. A.1.6 均质器或灭菌乳钵。A. 1. 7
9、 层析柱:40mmX (20 mm25 mm)。A.1.8 微量加样器:200L、50L.A. 1.9 细滴管。A. 1. 10 分液漏斗。A. 1. 11 透析袋。A. 1. 12 洗瓶。A. 1. 13 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。A. 1. 14 灭菌培养皿z直径150mm(或带盖搪瓷盘).A. 1. 15 灭菌锥形瓶:250mL。A. 1. 16 有机玻璃模板。A. 1. 17 打孔器g直径2.5mm. A. 1. 18 载玻片、橡皮圈。A. 1. 19 灭菌玻璃纸、三角棒、银子等A.2 培养基和试剂A.2.1 肠毒素产毒培养基z按GB/T47
10、89. 28-2003中4.86规定。A.2.2 营养琼脂g按GB/T4789. 28-2003中规定。A. 2. 3 1%琼脂糖(0.9%生理盐水配制溶液。A. 2. 4 0.2 mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液。A.2.5 三氯甲烧。A. 2. 6 6 mol/L盐酸溶液。A. 2. 7 5 mol/L氢氧化锅。A. 2. 8 0.85%生理盐水。A. 2. 9 1%乙酸溶液.70 A.2.10 0.1%唾嚓红R或氨基黑B。A.2.11 硅胶或凡士林。A.2.12 A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清.A.2.13 竣甲基纤维素(CM22或CMllWhatman)。A.2. 14 0
11、.2 mol/L pH6. 8磷酸盐缓冲液.A.2.15 酶标记A、B、C、D肠毒素抗血清或酶联免疫试剂盒.A. 2. 16 0.1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液。A. 2.17 0.05%0. 02mol/L pH7. 2吐温20缓冲液。A.2.18 邻苯二胶酶底物。A.2.19 2 mol/L硫酸。A.3 检验程序A.3.1 从菌株中检测肠毒素从菌株中检测肠毒素程序见图A.L营养琼脂斜面36C土1C.18h.24h 用盐水洗下菌菁.放产毒培养基固体培养法t36(;土1C培Jl!48h被悻培养法36C土1C摄黯培ell!48h8000 r/min离心20min.取上精液，加热lOOC
12、IOm皿8000r/min离心lOmin.榷缩国A.lA.3.2 从食物检样中提取和检测肠霉素A. 3.2.1 微玻片法检测肠毒素(浓缩法和层析法程序见图A.2.GB/T 4789. 10-2003 71 GB/T 4789. 10-2003 72 团体检样100g加入O.2 molfL pH7. 5睡酸盐疆忡幢lOOmL，4C浸抱18h - 24 hl攘体检样直接吸取lOOmL液体检样E离心8000r/min 20 min取上清液固体检样z离心8000r/min 20 min取上精液加入4扭币炕10rr止-15mL.报蕾10min.静置，弃去丁丁扭用统加入6moL盐被溶液调pH主4.5, 8
13、000 rlmin. 20 min.取上精液拥入5m叫n氢氧化铀南液，调pH主7.5, 8000 r/min, 20 nn 装入透析袋，以O.008 mollL pH5. 6晴酸盐缓忡液平菌榷缩法过CM层析柱【流速1mUmin - 2 mUmin) 用O.008 moVL pH5. 6幢酸盐缰忡液的100mL洗脱用0.2mollL pH6. 8晴酸盐缓忡砸洗脱出肠毒章层析法圈A.2A.3.2.2 黯联免疫法检测炀毒素程序见恩A.3.A.4 肠毒素检测用O.1 mol/L pH9_ 5碳酸盐罐忡液稀事血桐，加入辈乙烯凹孔板0.2mL. 36(:土1C30min 弃去上罐，用0.05%0.02 m
14、ollL pH7. 2吐温-20缰神被洗iIt五次液体检样直接加入极孔O.2mL;固悻植样100g+100 mL O.2mollLpH7.5磷酸盐锺忡被，均属后取撑液0.2mL. 36C土1C30 min 奔去上攘，用O.05% O. 02 mol/L pH7. 2吐温-20疆忡液洗蜂五次加入靡载体。.2mL. 36C土1C30mm 奔去上液，用。_051 0.02 mol/L pH7. 2吐温-20辍神液洗搔五次加入部辈二胶酶底物O.2mL.置室温30mnM2mollL硫酸O.05mL.立即出色圈A.3A.4.1 从菌株申提取肠霉素方法GB/T 4789. 10-2003 A. 4. 1.
15、1 液体透析培养法2用宽2.5cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析袋装人250mL锥形瓶内，加人15mL灭菌生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好.121c高压灭菌30mn，待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mmX180 mm).37C培养24h.用5mL生理盐水洗下菌落，倾人上述培养瓶中，每个菌种种一瓶.37C振荡培养48h.振速为100次/min，吸出菌液离心，8 000 r/min 30 min.取上清液做双相琼脂扩散，如为阴性，再装人透析袋内，用电风扇吹，或用多聚乙二醇，浓缩至1mL-2 mL.再做琼脂扩散eA. 4. 1. 2 固体透析培养法2向直径15
16、0mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾人灭菌产毒培养基约100 mL120 mL.凝固后表面铺一灭菌玻璃纸，待测菌株接种在营养琼脂上.37C培养24h.用约3mL 灭菌盐水洗下菌苔，倾在玻璃纸上，用灭菌三角棒涂满平皿.37C培养48h.加入10mL20 mL灭菌生理盐水，用灭茵三角棒刮取菌苔，吸取菌液离心，以下步骤同液体透析培养法。A. 4. 2 从食晶中提取肠霉素方法A. 4.2.1 直接浓缩法2取食品样品100g.:/JU入元菌O.2 mol!L pH7. 5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4C浸泡18h24 h.用纱布过滤将滤液离心8000 r/min20 min.取上清液，放入分液漏斗中，加入7
17、3 GB/T 4789. 10-2003 10 mL三氯甲烧，振摇10min，静置，将底层三氯甲烧弃去如不分层，可8000r/min离心20min)。加入6mol/L盐酸溶液调pH至4.5.8000 r/min离心20min，取上清液，加5mol/L氢氧化锅溶液，调pH至7.5.离心取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇浓缩至1mL2 mL.做微玻片双向琼脂扩散。A.4.2.2 层析法z如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸惰水洗下，装入透析袋，以0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液平衡，加入CM层析柱内，流速1mL/min2mL/min.用0.008mol/LpH5
18、. 6磷酸盐缓冲液洗脱，再用O.2 mol/LpH6. 8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻片双向琼脂扩散，检测肠毒素。A. 4. 3 双向琼脂扩散检测肠霉素A. 4. 3.1 微玻片法2将在95%乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干，吸取溶化的0.2%琼脂糖(蒸馆水配制滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放在无尘的环境中干燥，先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在
19、中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放入加有湿棉球的容器内，放25C30C、18h24 h观察结果。可在灯光上，并对着暗的背景观察，在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。具体内容见图A.4。A 时照厨毒章卢一/ 瞌检样抗血清幢幢样 撞撞样A一-被检样元肠毒素，为阴性pB B一一被检样3、5吉肠毒素，为阳性，4元肠毒素，为阴性.图A.4 时照踊毒章/ ，、被检样l 抗血槽1 被撞样 植栓梓A. 4. 3. 2 玻片法z吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL.铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成幅射型，孔距为2.5mm，中心孔加入肠毒素抗
20、血清，周围六个孔加入菌株或食品的肠毒素提取液，放人有滴加2/10000三氮化锅湿棉球的容器内，以保持湿度。置25C30C、18h20 h.观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。A. 4. 3.3 染色法:用微玻片法取下胶带和有机玻璃模板，玻片法可直接将玻片放人蒸馆水中浸泡4 h8 h.中间换2次3次水，在下述各液中浸10min.10%乙酸中含1%唾嚓红R(或氨基黑);1%乙酸;1%乙酸含1%甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35C烘干。阳性者沉淀被染上颜色，可长期保存。A.4.4 酶联免瘦法检测肠霉素(双抗体法)A. 4. 4.1 包被抗体g用O
21、.1 mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5g/mL.加人洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2mL.置36C土1C30 min.弃去上液。A. 4. 4. 2 洗涤z用0.05% O. 02 mol/L pH7. 2吐温-20缓冲液洗涤五次。A. 4. 4. 3 加入检样=如为液体，可直接加入0.2mL.固体样品取100g.Jm人0.2mol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液100mL.均质后取过滤液0.2mL, A. 4.4. 4 洗涤2同A.4. 4. 2 , 74 GB/T 4789. 10-2003 A. 4. 4.5 每孔内加入酶抗体0.2mL，置36C士1C30 min，同时做阳性和阴性对照。弃去上液。A. 4. 4.6 洗涤z同A.4.4. 2。A.4. 4. 7 每孔内加入邻苯二胶酶底物溶液0.2mL，室温放置30min. A.4.4.8 每孔内加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶标仪比色。A. 4. 4. 9 结果判定样品。D值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。75
