1、ICS 0710030C 53 a园中华人民共和国国家标准GBT 4789272008代替GBT 478927 2003食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验Microbiological examination of food hygiene-Examination of residue of antibiotics in fresh milk2008-1121发布 20090301实施宰翟捌翳鍪发布中国国家标准化管理委员会“刖 罱GBT 478927-2008本标准修改采用了国际分析家学会(AOAc)AOAC 98218液体牛奶制品中的B一乳胺抗生素定性的颜色反应试验(AOAC Offi
2、cial Method 98218：Betalactam antibiotics in fluid milk productsQualitative color reaction tests)作为第二法。本标准与AOAC 98218相比主要区别如下：一一扩大适用范围为鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种(Bacillus stearothermophilusvarcalidolactis)的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测；修改了试剂盒加营养片方法直接将含有试验菌株芽胞的培养基制备在小试管内；一将“注：偶尔有特殊批次的试剂盒可能需要较长的温育时间才能完全显色。如果
3、一每隔】0 min检查次颜色显示情况并记录每个批号产品所需要的最适当的温育时间。(Note：Occasionally kits of a particular I。ot Nomay require a longer incubation time for color tofully developIfCheck color development at 10 min intervals and record optimum incubation time required for each Lot No)”程序修改为“如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30 min作最终观察”；删除青霉素酶确证
4、程序。本标准代替GBT 478927 2003食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验。本标准与GBT 4789272003相比主要修改如下：标准名称修改为“食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验”；一增加了第二法，将原标准的嗜热乳酸链球菌方法确定为第法；一增加了附录A“培养基和试剂”。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：福建省疾病预防控制中心。本标准参加起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国检验检疫科学研究院、河南省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：马群飞、郭
5、云昌、李瑾、田卫、廖兴广、马弋、田静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：一GB 4789271984、GBT 4789271994、GBT 478927 2003。食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验GBT 47892720081范围本标准规定了鲜乳中抗生素残留的检验方法。本标准的第一法适用于鲜乳中能抑制嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的抗生素的检验第二法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种(Bacillus stearothermophilus varcalidolactis)的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测。第
6、一法嗜热链球菌抑制法2原理样品经过80杀菌后，添加嗜热链球菌菌液。培养一段时间后，嗜热链球菌开始增殖。这时候加人代谢底物2，3，5一氯化三苯四氮唑(TTC)，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，还原TTC成为红色物质。相反，如果样品中含有高于检测限的抑菌剂，则嗜热链球菌受到抑制，因此指示剂TTc不还原，保持原色。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：31冰箱：25、一20一5。32恒温培养箱：36士1。33带盖恒温水浴锅：361、802。34天平：感量01 g、0001 g。35无菌吸管：1 mL(具001 mL刻度)，100 m
7、L(具01 mL刻度)或微量移液器及吸头。36无菌试管：18 mm180 mm。37温度计：0100。38旋涡混匀器。4菌种、培养基和试剂41菌种：嗜热链球菌。42灭菌脱脂乳：见第A1章。43 42，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液：见第A2章。44青霉素G参照溶液：见第A3章。5检验程序鲜乳中抗生素残留检验程序见图1。CBT 4789272008图1 鲜乳中抗生素残留检验流程图6操作步骤61 活化菌种取一接种环嗜热链球菌菌种，接种在9 mI。灭菌脱脂乳中，置361恒温培养箱中培养12 h1 5 h后，置25冰箱保存备用。每1 5 d转种一次。62测试菌液将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭
8、菌脱脂乳，361培养1 5 h1 h，加入相同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成为测试菌液。63培养取样品9 mI。，置18 nlm180 mm试管内，每份样品另外做一份平行样。同时再做阴性和阳性对9GBT 4789272008照各一份，阳性对照管用9 mL青霉素G参照溶液，阴性对照管用9 mL灭菌脱脂乳。所有试管置802水浴加热5 min，冷却至37以下，加入测试菌液1 mI。，轻轻旋转试管混匀。361水浴培养2 h，加4TTc水溶液03 mL，在旋涡混匀器上混合15 s或振动试管混匀。361水浴避光培养30 rain，观察颜色变化。如果颜色没有变化，于水浴中继续避光培养30 min作最终观察。观察
9、时要迅速，避免光照过久出现干扰。64判断方法在白色背景前观察，试管中样品呈乳的原色时，指示乳中有抗生素存在，为阳性结果。试管中样品呈红色为阴性结果。如最终观察现象仍为可疑，建议重新检测。7报告最终观察时，样品变为红色，报告为抗生素残留阴性。样品依然呈乳的原色，报告为抗生素残留阳性。本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素0004 IU，链霉素05 IU，庆大霉素04 IU，卡那霉素5 IU。第二法 嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法8原理培养基预先混合嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，并含有pH指示剂(溴甲酚紫)。加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖
10、产酸，pH指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，pH指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。9设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：91 冰箱：25、20一5。92恒温培养箱：361、561。93恒温水浴锅：652、802。9，4无菌吸管或100 pL、200 pL微量移液器及吸头。95无菌试管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。96温度计：0100。97离心机：转速5 000 rmin。10菌种、培养基和试剂101菌种：嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种。102无菌磷酸盐缓冲液：见第A4章。103灭菌脱脂乳：见第A1章。1
11、04溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基：见第A5章。105青霉素G参照溶液：见第A3章。11检验程序样品中抗生素残留检验程序见图2。3GBT 478927-2008图2样品检验流程图12操作步骤121芽胞悬液将嗜热脂肪芽胞杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，561培养24 h后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，561培养24 h后转入361培养3 d4 d，镜检芽胞产率达到95以上时进行芽胞悬液的制备。每块平板用1 mL3 mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔(如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液10 mI。20 mL)。将洗脱液5 000 rrain离心15 rai
12、n。取沉淀物加003 molI。的无菌磷酸盐缓冲液(pH72)，制成109 CFUmL芽胞悬液，置802恒温水浴中10 min后，密封防止水分蒸发，置25保存备用。GBT 4789272008122测试培养基在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽胞悬液，混合均匀，使最终的芽胞浓度为810。CFUmL2106 CFUmI。混合芽胞悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管200 pL，密封防止水分蒸发。配制好的测试培养基可以在25保存6个月。123培养操作吸取样品100 pL加入含有芽胞的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀。每份检样做两份，另外再做阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为lOo p
13、I，青霉素G参照溶液，阴性对照管为100 pI无抗生素的脱脂乳。于652水浴培养25 h，观察培养基颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30 rain作最终观察。124判断方法在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30 rain再进行最终观察。如果培养基颜色仍然处于黄色一紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。13报告最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性。培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴
14、性。本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素3tgL，链霉素50 pgL，庆大霉素30tgI。卡那霉素50 p-gI。GBT 4789272008附录A(规范性附录)培养基和试剂A1灭菌脱脂乳A11成分无抗生素的脱脂乳。A12制法经115灭菌20 min。也可采用无抗生素的脱脂牛乳粉，以蒸馏水10倍稀释，加热至完全溶解，115灭菌20rain。A2 42，3，5-氯化三苯四氮唑(Trc)水溶液A21 成分2，3，5氯化三苯四氮唑(TTC) 1 g灭菌蒸馏水 5 mLA22制法称取TTC，溶于灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于25保存。如果溶液变为半透明的白色或淡褐色，则不能再用。临用时用灭菌蒸馏
15、水5倍稀释，成为4水溶液。A3青霉素G参照溶液A31成分青霉素G钾盐无菌磷酸盐缓冲液无抗生素的脱脂乳A32制法300 nag适量适量精密称取青霉素G钾盐标准品，溶于无菌磷酸盐缓冲液中，使其浓度为100 IUmI，1 000 IUmI一。再将该溶液用灭菌的无抗生素的脱脂乳稀释至0006 IUmI，分装于无菌小试管中，密封备用。一20保存不超过6个月。A4无菌磷酸盐缓冲液A41成分磷酸二氢钠磷酸二氢钾蒸馏水A42制法283 g136 g1 000 ml。将上述成分混合，调节pH至7301，121高压灭菌20 min。A5溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基A51成分蛋白胨葡萄糖100 g50 g2溴甲酚紫乙醇溶液琼脂蒸馏水A52制法06mL40 g1 000 mI。GBT 4789272008在蒸馏水中加入蛋白胨、葡萄糖、琼脂，加热搅拌至完全溶解，调节pH至7101，然后再加入溴甲酚紫乙醇溶液，混匀后，115高压灭菌30 min。
