1、GB/T 4789.29-2003 前本标准对GB/T4789.29-1994食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验进行修订。234 本标准与GB/T4789.29-1994相比主要修改如下=-一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。规范原标准中的设备和材料。本标准自实施之日起，GB/T4789.29-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人，X1J秀梅、臼竟玉、付挥、杨宝兰。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。1 范围食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验
2、GB/T 4789.29-2003 本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 11675 银耳卫生标准3
3、 设备和仪器3. 1 冰箱24-20。3.2 恒温培养箱326C土IC、36C士1C。3.3 恒温水浴锅，46C土IC。3.4 显微镜，10X100X。3.5 离心机，4000r/min, 3.6 架盘药物天平，0g500 g.精度。.5 g , 3. 7 锥形瓶，100mL、500mL, 3.8 灭菌吸管，1mL(具0.01mL刻度、10mL(具0.1mL刻度)。3.9 灭菌平皿:直径90mm.120 mm, 3. 10 灭菌试管，16mmX160 mm, 3. 11 离心管30mmXI00 mm。3. 12 小试管，10口lmXI00mm。3. 13 灭茵L形玻璃棒。3. 14 灭菌透明玻
4、璃纸、滤纸。3. 15 灌胃器=lmL。3. 16 小白鼠，18g20 g , 4 培养基和试剂4. 1 革兰氏染色液2按GB/T4789. 28配制。4.2 氧化酶试验z按GB/T4789. 28执行。4. 3 马铃薯葡萄糖琼脂CPDA)，按GB/T4789.28配制。4.4 马铃薯葡萄糖半固体琼脂z按4.3PDA配方，琼脂量减至0.5g/100 mL。4.5 马铃薯葡萄糖水CPD水)，按4.3PDA配方，不加琼脂。235 GB/T 4789.29-2003 4.6 GVC增菌液(椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用在高压灭菌的PD水(4日中，以无茵手续加龙胆紫水浴液(最终浓度为1/10万)氯霉素水
5、溶液(最终浓度为20g/mLl混匀、分装后置4C备用。4. 7 卵黄琼脂z按GB/T4789. 28配制。4.8 SS琼脂按GB/T4789. 28配制。4.9 Hugh-Leifson培养基O/F试验用:按GB/T4789.28配制。4. 10 蛋白陈水(能基质试验用按GB/T4789. 28配制。4. 11 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用h按GB/T4789. 28配制。4. 12 西蒙氏拧橡酸盐培养基:按GB/T4789.28配制。4. 13 苯丙氨酸培养基按GB/T4789. 28自己制。4. 14糖发酵管s按GB/T4789.28配制。4. 15半固体琼脂按GB/T4789.2
6、8配制。4. 16 抗0多价血清、型特异性因子血清()-m、0-町、()-V、()-V!、()-Vll型、()-V面型)。5 检验程序椰毒假单胞菌酵米面亚种检验程序见图1。槛样增离淀腼樊食晶25g+225mLGVC增菌檀蚌银耳19+20mLGVC增菌液固1236 6 操作步骤6. 1 增菌GB/T 4789.29-2003 用无菌操作取样品25g.加入盛有225mL增菌液的锥形瓶中(鲜银耳样品取1g.用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的锥形瓶中)36C土1C培养48h。6.2 分离、纯化培养取增菌液一接种环，划线接种PDA平板.36C士JC培养24h48 h，观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑
7、单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及55琼脂平板.36C土1C分别培养48h和24h.椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征见表1。表1椰霉假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征培养基菌落特征PDA平板菌落1mm-2 mm，灰白或乳白色，光滑、温润、边缘整齐.培养48h后，中心有凸起，呈草帽状，菌落周围有黄绿色素扩散到基质中卵黄琼脂平板菌落表面光滑、湿润.48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射日光下可见环的表面呈虹影现象SS琼脂平板不生长从卵黄琼脂平板上挑取卵磷脂酶阳性，并带有虹移环的单个菌落，接种PDA斜面.36C士
8、1C培养24 h.供下步试验用。6.3 生化试验从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh-Leifson培养基、蛋白陈水、缓冲蛋白陈水、西蒙氏拧攘酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基.36C士1C培养，按单项试验的要求分别进行观察。椰毒假单胞菌酵米面亚种生化性状见表2。动力OIF试验(0型)葡萄糖果糖木糖半乳糖阿拉伯糖甘露醇肌醇卫茅醇硝酸盐还原6.4 血清学分型鉴定6. 4. 1 0抗原的制备阳表2椰毒假单胞菌酵米面亚种生化性状性阴性尿素氧化酶明胶液化青童基质卵磷脂酶v-P 侧金盏花醇MR 拧橄酸盐利用H，S产生精氨酸5C不生长石琼牛乳41 c不生长37 c生长将马铃薯葡萄糖琼脂C
9、PDAJ斜面36C士1C.24 h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h.离心弃上清液，再用灭菌生理盐水稀释至5亿/mLJO亿/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。6. 4. 2 0抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用。田、Q-lV、0-237 GB/T 4789.29-2003 V、VI、W型、O-Wl型因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定O抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化学性状符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步的鉴定。6.5 毒性试验6.5. 1 产毒培养取己鉴定为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面.36C士1C.培
10、养24h.加入3mL灭菌生理盐水，制成约100亿/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取O.5 mL.滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上，用灭菌L形玻璃棒涂布均匀.26C:I:1C培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板放入消毒锅内.100C流动蒸气灭菌30min.室温冷却后，置lOC -20C冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用灭菌吸管取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或锥形瓶中.4c避光保存。此为粗毒素。6.5.2 毒力测定取粗毒素或经水浴蒸发的5倍10倍浓缩液0.5mL.灌胃小白鼠三只，体重18g20 g.观察7d. 若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20min24 h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎靡不振，继而躁动，行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搞，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。6.5.3 米酵菌酸测定按照GB/T11675执行。238
