1、ICS 07.100.30 C 53 4岳2-, 共晶卫肠GB/T 4789. 32 2002 Microbiological examination for food hygiene rapid detection of coliform bacteria 2002 -06-13发布2002斗。-01实中华家人民共和国监督检验检痊总局发布GB/T 4789. 32-2002 目次前言. . . . . . . . . . . . . . .,. . I 引言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . E 1 范围. . . . . . . . . . . .
2、. . 1 2 规范性引用文件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 4 原理. . . . . . . . 1 5 试剂和培养基. . . . . . . 1 6 设备和器材. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 检验程序. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 样品的制备. . . . . . . . . 3 9 大肠菌群的MPN
3、计数. . . . . . . . . . . . . . . . . 3 10 大肠茵群的菌落计数4 附录A(规范性附录)大肠菌群最可能数(MPN)检索表. . . ,. . 5 厂一一二一一GB/T 4789. 32-2002 前本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验方法。本标准规定使用的培养基MUGal肉汤中的4甲基伞形酣-D半乳糖昔与美国联邦法规40.第141节.21款(Codeof Federal Regulations 40.Part 141 21)规定的检验大肠菌群所用的MI琼腊的主要成分(4-甲基伞形翻-D-半乳糖背)是同一物质.本标准关于大肠茵群的菌落计数，参考了ISO4832
4、 , 1991(EH微生物学一一大肠菌群菌落计数法通则(Microbiology-Generalguidance for the enumeration of coliforms-colony count techniqu吵。本标准中的附录A是规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准主要起草单位z镇江出人境检验检疫局、中国标准化协会、镇江质量技术监督局。本标准主要起草人z到宏太、李平、张秀春、闵继福。GB!T 4789. 32-2002 冒|言大肠菌群系指一群能发院乳糖、产酸或怪，并产生严半乳糖背酶需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌.该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪
5、便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能.如果大肠菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。E 一一L 一一2 范围品卫生微生物学检验大肠茵群的快速本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数.规范性引用文件二丁GB/T 4789. 32-2002 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否
6、可使用这些文件的最新版本。凡是不注臼期的引用文件，其最新版本适用于本标准.3 GB 4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂1S0 4832: 1991(E) 微生物学一一大肠菌群菌落计数法通则术语和定义下列术语和定义适用于本标准3. 1 大肠菌群coliform bacteria 大肠菌群是革兰氏阴性、无芽抱、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐或具有其他抑制生长的表面活性剂)存在的情况下生长，通常可在36C土2C发酵乳糖并产酸和醒。具有-半乳糖背酶。在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解-半乳糖背、使培养基发出荧
7、光或生成紫色(或红色茵落的一群革兰氏阴性元芽抱杆菌。4 原理4. 1 最可能数(MPN)法大肠菌群可产生-半乳糖背酶，分解液体培养基中的酶底物一-4甲基伞形翻-D-半乳糖背(以下简称MUGal)，使4-甲基伞形酣游离，因而，在波长366nm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。4.2 平板法大肠菌群可产生-半乳糖背酶，分解培养基中的酶底物菌素-D-半乳糖背(以下简称Aliz-ga) ，使茜素游离并与固体培养基中的铝、何、铁、钱离子结合形成紫色(或红色的整合物，使菌落呈现相应的颜色。5 试剂和培养基5. 1 磷酸盐缓冲液按GB4789.28-1994中3.22规定进行制备.5.2 生理盐水5.2.1 成
8、分氯化纳8.5 g 1 GB/T 4789. 32-2002 蒸馆水5.2.2 制法1000 mL 将氯化纳溶于蒸馆水.121C蒸汽灭菌15mino 5.3 MUGal肉汤5. 3. 1 成分院蛋白陈或膜酸陈氯化纳无水磷酸氢二梆无水磷酸二氢饵月桂基硫酸纳MUGa!(纯度不低于99%)蒸馆水5.3.2 制法20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 0.1 g 0.08 g 1000 mL 将各成分加热溶于蒸馆水中，以15%-20%氢氧化纳溶液调整pH值，分装于20mmX150 mm试管，每管9mL.1!6C蒸汽灭菌10min，最终pH值7.0-7.20待培养基冷却后，以元菌手续于每管
9、培养液内加入0.1mL经无菌水稀释的500问/mL头抱磺硫液或于1000mL灭菌培养液内加1mL经无菌水稀释的5mg/mL头抱磺晓浓并以无菌操作分装试管。注g双料MUGal肉汤除蒸倒在外，其他成分加倍.5. 4 Aliz-gal琼脂5.4. 1 成分膜蛋白陈或膜酷陈氯化纳无水磷酸氢二何无水磷酸二氢御月桂基硫酸钩Aliz-ga! (纯度不低于97%)异丙基硫代半乳糖背硫酸铝伺拧稼酸铁钱琼脂蒸馆水5.4.2 冒出j法20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 0.1 g 0.05 g 0.03 g 0.5 g 0.5 g 15.0 g 1000 mL 将各成分放入蒸馆水中，加热使溶化，以
10、15%-20%NaOH调整pH傻，分装烧瓶.1!6C蒸汽灭菌10 min，最终pH值7.0-7.206 6. 1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 2 设备和器材培养箱:3TC士1C。冷藏箱:OC土4Co 天平g感量0.01g 均质器或乳钵。平皿2直径90mmo 试管:20mmXl50mmo吸管:1.0 mL和10.0mL。一一一-z一一一一一一6.8 广口瓶或三角瓶z容量500mL。6.9 玻璃珠z直径约5mmo 6.10试管架。6.11 紫外灯(波长366nm)o 6.12其他。7 检验程序见图10MUGaI向西【MPN法37t:土Jt:18h-24h 在波长366nm量外灯
11、下置暗处观事有荧光二一一二一一一一检样稀挥Aliz-gal琼黯平植法3TC土rc18h -24h 计量置色或虹色菌喜GB/T 4789. 32-2002 大局菌群阳性大肠菌群阴性图1检验程序B 样品的哥哥备8. 1 以无菌手续取25mL(或25g)样品，加于含225mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的广口瓶(或三角瓶)内(瓶内预宣适当数量的玻璃珠).充分振摇或用均质器以8000r/m-10 000 r/m均质1 rnin成1 10稀释液。8.2 用1mL无菌吸管吸取1 10样品稀释液1.0 mL.注入含9.0mL元菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的试管内，振摇均匀，即成1I 100样品稀释液。8.
12、3 另取1.0mL无菌吸管，按上法制备10倍递糟样品稀释液。每递增一次，换一支1.0mL无茵吸管.8.4 根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基(MPN法或两个平皿(平板法)。9 大肠菌群的MPNit数9. 1 将待检样品和样品稀释液接种MUGal肉汤管，每管1.0mL(接种量在1.0 mL以上者，接种双料MUGaI肉汤管。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种3管培养基。同时另取2支MUGaI肉汤管(或双料MUGaI肉汤管)加入与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)作空白对照.9.2将接种后的培养管置于3TC土lC培养
13、箱培养18h-24 h。9.3 将培养管置于暗处，用波长366nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管s如未显一一一一一G/T 4789. 32-2002 蓝色荧光，则为大炀茵群阴性管。9.4 结果报告g根据大肠茵群阳性管数，查MPN表(见附录A)，报告每100mL(g)食品中大肠菌群MPN值。大肠菌群的菌落计数10 10.1 用灭菌吸管吸取待检样液1.0 mL，加入无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿.10.2 于每个加样平皿内倾注15mL45C50C的Aliz-gal琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀.待琼脂凝固后，再倾注3mL5 mL Aliz-gal
14、琼脂覆盖表面。同时将Aliz-gal琼脂倾入加有1mL上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的元菌平皿内作空白对照。10.3 待琼脂凝固后，翻转平板，于37C土lC培养箱培养18h24 h。取出平板，计数紫色(或红色茵落。10.4 结果报告10.4.1 当平板上的紫色(或红色茵落数不高于150个，且其中至少有一个平板紫色(或红色)茵落不少于15个时，按式(1)计算大肠菌群数2) l ( N 一二E(n, + n,)d 式中2N一一样品的大肠菌群数，个/mL或g，c-所有计数平板上，紫色(或红色菌落数之总和sn，一一供计数的最低稀释倍数的平板数gn，一一供计数的高一稀释倍数的平板数;d 供计数的样品
15、最低稀释度(如10-，10-2，10-3等)。10.4.2 如接种所有(3个)稀释样品的平板上，紫色(或红色茵落数均少于15个时，仍按式(1)计算，但应在所得结果旁加铃号，表示为估计值。10.4.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于15个时，报告结果为z每毫升克)样品少于15个大肠茵群.10.4.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色(或红色)茵落数时，报告结果为:每毫升克样品少于1个大肠菌群。10.4.5 如平板上的紫色或红色茵落数高于150个时，按式(1)计算，在结果旁加铃号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定.4 L 、GB
16、jT 4789.32-2002 附录A (规范性附录大肠茵群最可能数(MPN)检索襄表A.l阳性管数95%可信限1mL(g)X3 0.lmL(g)X3 0.0ImL(g)X3 MPN 100 mL(g) 下限上限。30 。1 30 5 90 。2 60 。3 90 。1 。30 。1 1 60 5 130 。1 2 90 。1 3 120 。2 。60 。2 1 90 。2 2 120 。2 3 160 。3 。90 。3 1 130 。3 2 160 。3 3 也1901 。40 5 200 I 。l 70 10 210 1 。2 110 1 。3 150 1 1 。70 10 230 I
17、1 1 110 30 360 1 1 2 150 1 1 3 190 1 2 。110 30 360 1 z I 150 1 2 2 200 1 2 3 240 l 3 。160 1 3 I 200 1 3 2 240 1 3 3 290 2 。90 10 360 2 。1 140 30 370 2 。2 200 2 。3 260 5 GB/T 4789. 32-2002 表A.l(续)阳性管数95%可信限MPN 100 mL(g) 1 mL(g)X3 0.1 mL(g)X3 0.01 mL(g)X 3 下限上限2 l 。150 30 440 2 1 1 200 70 890 2 1 2 27
18、0 2 l 3 340 2 2 。210 40 470 2 2 1 280 100 1 500 2 2 2 350 2 2 3 420 2 3 。290 2 3 l 360 2 3 2 440 2 3 3 530 3 。230 40 1 200 3 。1 390 70 1300 3 。2 640 150 3800 3 。3 950 3 1 。430 70 2100 3 1 1 750 140 2300 3 1 2 1 200 300 3800 3 1 3 1 600 3 2 。930 150 3800 3 2 1 1 500 3口。4400 3 2 Z 2 100 350 4700 3 2 3
19、 2 900 3 3 。2400 360 13000 3 3 1 4 600 710 24000 3 3 2 11 000 1 500 48000 3 3 3 ;24 000 注1，本表采用3个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g汀，每稀释度3管.注2表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字相应降低10倍IQ改用。1mL(g)、0.01 mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍.其余可类推.6 L 一一一一一一-一二一一32-2002 、.中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测GB/T 4789.32-2002 睡中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码1100045电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售普开本880X1230 1/16 印张3/4字数16千字2002年9月第一版2002年9月第一次印刷印数1-3000晤书号，155066 1-18727 网址版权专有侵权必究举报电话，(010)68533533
