1、GB/T 4789.5-2003 34 前言本标准对GB/T4789. 5-1994(食品卫生微生物学检验志贺氏茵检验进行修订。本标准与GB/T4789. 5-1994相比主要修改如下.-一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。修改并规范原标准中的设备和材料本标准自实施之日起，GB/T4789. 5-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:江西省卫生防疫站、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.本标准主要起草人何晓青、冉陆、付萍、杨宝兰、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订。1 范围食品卫生微生物
2、学检验志贺氏菌检验本标准规定了食品中志贺氏菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中志贺氏菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789.5-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱504。3.2 恒温培养箱236土lOC.42C。3.3 显微镜:lOX100X。
3、3.4 均质器或灭菌乳钵。3.5 架盘药物天平:0g500 g.精确至0.5go 3.6 灭葛广口瓶:500mLo 3. 7 灭菌锥形瓶:500mL、250mLo 3.8 灭菌培养皿z直径90mm。3.9 硝酸纤维素滤膜:150mmX50 mm.ro.45mo临用时切成两张，每张70mmX50 mm.用铅笔划格，每格6mmX6 mm，每行10格，分6行。灭菌备用，4 培养基和试剂4.1 GN增菌液z按GB/T4789. 28-2003中4.17规定。4.2 HE琼脂z按GB/T4789.28-2003中4.21规定，4.3 SS琼脂z按GB/T4789. 28-2003中4.22规定。4.4
4、麦康凯琼脂z按GB/T4789.28-2003中4.24规定。4.5 伊红美蓝琼脂(EMB):按GB/T4789.28-2003中4.25规定。4.6 三糖铁琼脂(TSD:按GB/T4789.28-2003中4.26、4.27规定。4. 7 葡萄糖半固体管s按GB/T4789. 28-2003中4.31规定。4.8 半固体管:按GB/T4789.28-2003中4.30规定。4.9 葡萄糖镀琼脂=按GB/T4789.28二2003中3.8规定。4. 10 尿素琼脂(pH7.2):按GB/T4789. 28-2003中3.15规定。4. 11 西蒙氏拧橡酸盐琼脂g按GBjT4789. 28-20
5、03中3.5规定a4. 12 氟化饵(KCN)培养基:按GB/T4789. 28-2003中3.16规定。4. 13 氨基酸脱竣酶试验培养基z赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，按GBjT4789. 28-2003中3.12 35 GB/T 4789.5-2003 规定。4. 14 糖发酵管z棉子糖、甘露醇、甘油、七叶背及水杨苦，按GB/T4789. 28-2003中3.2规定。4. 15 5%乳糖发酵管g按GB/T4789. 28-2003中4.32规定。4. 16 蛋白陈水、能基质试弗IJ:按GBjT4789.28一2003中3.13规定。4. 17 志贺氏菌属诊断血清。5 检验程序志贺氏菌检验程
6、序见图1。撞捍25 g+GN 225 mL 36(0土1C，6h-8hHE琼脂或ss36(0土1C，18h-24h提取可疑菌落TSI，葡萄糖半固体丁TSI属层产醋，斜面产晤，HS-. 不产气，无动力血槽学分型边一步的生化试验生化分群试验葡萄糖镀试验、西蒙氏拧楝酸盐、赖氨酸、尿素、佩化怦(KCN)、水杨昔和七叶昔志贺民菌眉咽萄糖镀+分群且分型结果或任何其他阳性结果非在贾氏菌报告图136 量靡凯或EMB非如左述的各种反应结果非革贺民菌6 操作步骤6. 1 增菌GB/T 4789.5-2003 以元菌操作取检样25g(mL).加入装有225mL GN增菌液的广口瓶内，固体食品用均质器以8 000 r
7、/min 10 000 r/min打碎1min，或用乳钵加灭茵砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃捧研磨使其乳化，于36C培养6h8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。6.2 分离和初步生化试验6. 2. 1 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或ss琼脂平板一个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板一个，于36c培养18h24 h.志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。6.2.2 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36c培养18h24 h.分别观察结果。6.2.3 下述培养物可以弃去
8、ga) 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物gb) 在18h24 h内发酵乳糖、煎糖的培养物p。不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物5d) 产气的培养物;e) 有动力的培养物;f) 产生硫化氢的培养物。6.2.4 凡是乳糖、煎糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体).无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。6.3 血清学分型和选一步的生化试验6.3. 1 血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查p如果呈现凝集，则用A1、A2，B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志
9、贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用瘸疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。褒1福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原型和亚型型抗原群抗原在群因子血清中的凝集3.4 6 7.自1. I 1.2.4.5.9. 十1b I 1.2,4,5.9 十+ 2. E 1.3.4. + 2b E 1,7,8,9. 十3. E 1,6,7,8,9. + +
10、3b E 1.3.4.6. . + 十4. H 1, (3 ,4) (十)4b H 1.3.4.6. + + 5. V 1.3.4 + 5b V 1.5.7,9. + 6 H 1.2, (4) (+ ) X变体1.7,8,9. . 十Y变体1.3,4 + 注，+凝集$不凝集;( )有或元.37 GB/T 4789.5-2003 6.3.2 避一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即:葡萄糖钱，西蒙氏拧橡酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶.pH7.2尿素，氟化御(KCN)生长，以及水杨苦和七叶昔的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做
11、革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰民阴性轩菌，生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘泊的发酵和能基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表20表2志贺氏菌属四个群的生化特性生化群5%乳糖甘露醇棉于糖甘油青童基质A群g荆疾志贺氏菌+) /+ B群福氏志贺氏菌+ + (十)C群2鲍氏志贺民菌+ +) /+ D群z宋内氏志贺氏菌十八+)十十d 注2一阳性;一阴性，-/十多数阴性，少数阳性，+)迟缓阳性，d有不同生化型。6.4 结果报告综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。38
