1、GB/T 4789.6-2003 40 前言本标准对GB/T4789. 6一1994(食品卫生微生物学检验致泻大炀埃希民茵检验进行修订。本标准与GB/T4789.6-1994相比主要修改如下g一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一一修改并规范原标准中的设备和材料。本标准自实施之日起.GB/T4789. 6-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位z江西省卫生防疫站、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人.何晓青、冉陆、付萍、姚景会。本标准于1984年首次发布.1994年第一次修订，本次为第二次修订.1 范围食晶卫生微
2、生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789. 6-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱304。3.2 恒温培养箱336土rc，42C。3.3
3、 恒温水浴锅，100C，65 C 68C， 50C。3.4 显微镜210100。3.5 离心机，3000 r/min. 3.6 酶标仪。3. 7 均质器或灭菌乳钵。3.8 架盘药物天平，0 g500 g，精确至0.5g. 3.9 细菌浓度比浊管，MacFarland3号。3. 10 灭菌广口瓶，500mL。3. 11 灭菌锥形瓶，500mL , 250 mL。3. 12 灭菌吸管，1mL(具0.01mL刻度)、5mL(具0.1mL j度)。3. 13 灭菌培养皿2直径90mm. 3. 14 灭菌试管，10mmX75 mm、16mmX160 mm。3. 15 注射器，0.25mL，连接内径为1m
4、m塑料小管-段。3. 16 灭菌的刀子、剪子、银子等。3. 17 Jj、白鼠z1日4日龄。3. 18 硝酸纤维素滤膜150mmX 50 mm ,ro. 45m。临用时切成两张，每张75mmX50 mm，用铅笔划格，每格6mmX6 mm，每行10格，分6行。灭菌备用。41 GB/T 4789.6-2003 4 培养基和试JiJ4. 1 乳糖胆盐发酵管2按GB/T4789.28-2003中4.9规定。4.2 营养肉汤2按GB/T4789. 28一2003中4.8规定B4.3 肠道菌增菌肉汤2按GB/T4789. 28-2003中4.18规定。4.4 麦康凯琼脂g按GB/T4789. 282003中
5、4.24规定。4.5 伊红美蓝琼脂CEMB):按GB/T4789. 28-2003中4.25规定。4.6 三糖铁琼脂CTSI):按GB/T4789. 28-2003中4.26，4.27规定，4. 7 克氏双糖铁琼脂(KI):按GB/T4789. 28-2003中4.28，4.29规定。4.8 糖发酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇):按GB/T4789. 28-2003中3.2规定甸4.9 赖氨酸脱竣酶试验培养基.按GB/T4789. 28-2003中3.12规定。4. 10 尿素琼脂(pH7.2):按GB/T4789. 28-2003中3.15规定.4. 11 氟化梆CKCN)培养基z按GB/
6、T4789. 28-2003中3.16规定。4. 12 蛋白陈水、能基质试弗U:按GB/T4789. 28-2003中3.13规定。4. 13 半固体琼脂g按GB/T4789. 28-2003中4.30规定。4. 14 Honda氏产毒肉汤z按GB/T4789. 28-2003中4.34规定。4. 15 Elek氏培养基2按GB/T4789. 28-2003中4.35规定。4. 16 氧化酶试剂:按GB/T4789. 28一2003中3.18规定.4. 17 革兰氏染色液z按GB/T4789. 28-2003中2.2规定.4. 18 致病性大Jl埃希民葛诊断血清、侵袭性大局埃希民菌诊断血清、产
7、Jl毒素大炀埃希民菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4. 19 产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒。4.20 产肠毒素LT和ST大肠埃希氏菌标准菌株。4.21 抗LT抗毒素。4.22 多粘菌素B纸片:300IU，世16mm。4.23 O. 1 %硫柳柔溶液。4.24 2%伊文思蓝溶液。5 检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1 42 GB/T 4789.6-2003 检样测大局菌群MPN 25g+曹养肉汤225 mL 持!Ii严重的栓样勾液36C土1C6h 乳糖盎静阳性的发醇曹肠道菌增菌肉面查屠凯E胁1836C土1C18h-24h -一-_.一.斗斗图143 GB/T 4789
8、.6-2003 6 操作步骤6. 1 增菌样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操作取检样25 g(mL) ，1m在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN.其余的移人500mL广口瓶内，于36C土1C培养6h，挑取l环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42C培养18h。6.2 分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板;污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36C土1C培养18h24 h.观察菌落。不但要注意乳糖发酵的
9、菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。6.3 生化试验6.3. 1 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSD或克氏双糖铁琼脂(KD。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱竣酶试验培养基。以上培养物均在36C培养过夜。6.3.2 TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸.H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰民染色。6.4 血清学试验6. 4. 1 假定试验:挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃
10、希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价0血清和出血性大肠埃希氏菌0157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价0血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价0血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表1。如与某一个单价。血清呈现强凝集反应，即为假定试验阴性。表1致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群大肠埃希民菌的种类所包括的O抗原群026 055 086 0111.b 0114 0119 0125.c 0127 0128.b EPEC 0142 0158 EHEC 0157 028.c 029 0112.c 0115 0124 0135 0136 0143 0144 E1EC 0152 0
11、164 0167 06 011 015 020 025 027 063 078 085 0114 0115 ETEC 0126 01280c 0148 0149 0159 0166 0167 6.4.2 证实试验z制备0抗原悬液，稀释至与MacFarland 3号比浊管相当的浓度。原效价为(1 : 160)(l : 320)的O血清，用。.5%盐水稀释至1: 40。稀释血清与抗原悬液在10mmX75 mm 试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50C水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。6.5 肠毒素试验6. 5. 1 酶联免疫吸附试验枪测LT和ST6. 5. 1.
12、1 产毒培养2将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6m LCAYE培养基内，37C振荡培养过夜。加入20000 IU/mL的多粘菌素B0.05 mL.于37C1 h.离心4000r/min 15 min，分离上清液，加入0.1%硫柳录。.05mL，于4C保存待用a6. 5. 1. 2 L T检测方法双抗体夹心法): a) 包被先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入44 GB/T 4789.6-2003 包被液0.5mL.混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100L量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4C冰箱湿盒中过夜。b
13、) 洗板z将板中洛液甩去，用洗涤液I洗三次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。c) 封闭z每孔加100L封闭液，于37C水浴中1ho d) 洗板:用洗涤液E洗三次，操作同上。e) 加样本z每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100L.37C水浴中1ho f) 洗板g用洗涤液E洗三次，操作同上。g) 加酶标抗体=先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100L.37C水浴中1ho h) 洗板s用洗涤液E洗三次，操作同上.i) 酶底物反应z每孔(包括第一孔)各加基质液100L.室温下避光作用5min.lO min，加人终止液50Loj
14、) 结果判定z以酶标仪在波长492nm下测定吸光度。D值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。6.5. 1. 3 ST检测方法(抗原竞争法ha) 包被E先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6 mL包被液中混匀，以每孔50L加入于40孔聚苯乙烯软反应板中，加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置40C冰箱湿盒中过夜。b) 洗板=用洗涤液I洗三次，操作同上。c) 封闭g每孔加100L封闭液.37C水浴1ho d) 洗板s用洗涤液E洗三次，操作同上。e) 力日佯本及ST单克隆抗体z每孔分别加各试验茵株产毒培养液50
15、L，稀稀的ST单克隆抗体50L(先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6 mL稀释液中，混匀备用).37C水浴1ho f) 洗板=用洗涤液E洗三次，操作同上。g) 加酶标记兔抗鼠Ig复合物:先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100L，370C水浴1ho h) 洗板s用洗涤液E洗三次，操作同上。酶底物反应s每于L(包括第一孔)各加基质液100L.室温下避光5min,._, lO min，再加入终止液50Lo j) 结果判定z以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(ODJ值，计算见式(1): 一阴性对照OD值一待测
16、样本OD值。J吸光度一一x 100% . ( 1 ) 阴性对照OD值川吸光度大于等于50%为阳性。目测元色或明显淡于阴性对照为阳性。6.5.2 双向琼脯扩散试验检测LT将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36C培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36C经5h6 h.使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm 处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30L.用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36C经15h20 h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，元沉淀带者为阴性。6.5.3 乳鼠灌胃试验检测ST将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36C培养24h.以3000 r/min离心30min，取上清液45 GB/T 4789.6-2003 经薄膜滤器过滤，加热60C30min.每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL.将此滤液用塑料小管注入1日4日龄的乳鼠胃内0.1mL.同时接种3只4只，禁食3h4h后用三氯甲炕麻醉，取出全部肠管，称量肠管(包括积液)重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于O.09为阳性，O. 07 O. 09为可疑。6.6 结果报告综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。46
