1、Jcs 0710030C 53 酉圄中华人民共和国国家标准GBT 478972008代替GBT 4789720032008-05-1 6发布食品卫生微生物学检验副溶血性弧茵检验Microbiological examination of food hygiene-Examination of Vibrio parahaemolyticus2008-1卜01实施宰篓发布中国国家标准化管理委员会促111刖 置GBT 478972008本标准修改采用了美国食品药品管理局(FDA)细菌学分析手册第9章：霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和其他弧菌(Bacteriological Analytical M
2、anual，Chapter 9：Vibrio cholerae，Vparahaemolyticus，VvulniCUS and other vibrio spp)。本标准与FDA方法相比主要区别如下：将样品制备时取样量50 g(mL)修改为25 g(mL)；将增菌时间16 h18 h修改为8 h18 h；增加科玛嘉弧菌选择性平板；增加全自动细菌生化鉴定仪VITEK；抗原表中增加了新的血清型。本标准代替GBT 47897 2003食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验。本标准自实施之日起，GBT 478972003同时废止。本标准与GBT 478972003相比主要变化如下：将选择性增菌液由氯化
3、钠结晶紫增菌液改为3氯化钠碱性蛋白胨水；将选择性分离培养基由氯化钠蔗糖琼脂和嗜盐菌选择性琼脂改为硫代硫酸盐一柠檬酸盐一胆盐一蔗糖琼脂和科玛嘉弧菌显色培养基；增加API 20E诊断试剂条及全自动细菌生化鉴定仪VITEK；增加血清学分型；将动物试验改为神奈川试验；增加最可能数检索表。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位：福建省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：刘秀梅、陈艳、马群飞、程苏云、陈彦长、陈倩。本标准所
4、代替标准的历次版本发布情况为：GB 478971984，GBT 478971994，GBT 478972003。1范围食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验GBT 478972008本标准规定了食品中副溶血性弧菌(Vibriornnemozy矗c“s)的检验方法。本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。21恒温培养箱：361。22冰箱：25。23均质器或无菌乳钵。24天平：感量01 g。25无菌试管：18 mm180 mm，15 mmXl00 mm。26无菌吸管：l mL(具001 mL刻度)，
5、10mL(具01 mL刻度)或微量移液器及吸头。27无菌锥形瓶：500 mL，250 mL。28无菌培养皿：直径90 mm。29 全自动微生物鉴定系统(VITEK)”。210无菌手术剪、镊子。3培养基和试剂3，I 3氯化钠碱性蛋白胨水(APW)：见第A1章。32硫代硫酸盐一柠檬酸盐一胆盐一蔗糖(TCBS)琼脂：见第A2章。33 3氯化钠胰蛋白胨大豆(TsA)琼脂：见第A3章。34 3氯化钠三糖铁(TSI)琼脂：见第A4章。35嗜盐性试验培养基：见第A5章。36 3氯化钠甘露醇试验培养基：见第A，6章。37 3氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见第A。7章。38 3氯化钠MRvP培养基：见第A8章。
6、39我妻氏血琼脂：见第A9章。310氧化酶试剂：见第A10章。3”革兰氏染色液：见第A11章。312 ONPG试剂：见第A12章。313 VogesProskauer(V-P)试剂：见第A13章。314科玛嘉(CHROMagar)弧菌显色培养基”。315 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK NFC生化鉴定卡”。1) 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2) 由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产
7、品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GBT 4789720084检验程序副溶血性弧菌检验程序见图1。样品25 g(mL)-225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水 I3氯化钠碱性蛋白胨水3管x 3个合适的稀释度如果进行定性检测，则不需要进行此步骤361，8 h18 h硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐一蔗糖琼脂或科玛嘉弧菌显色培养基划线分离36l，18h24 h挑取可疑菌落，接种于3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂36l，18 h24h筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验生化试验或选用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK结果报告血清学试验、神奈川试验图1 副溶血性弧菌检验程序5操作步骤
8、51样品制备511冷冻样品应在45以下不超过15 rain或在25不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于一15左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置25C冰箱保存，在24 h内检验。512鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。513以无菌操作取检样25 g(mL)，加入3氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 rmin均质1 rain，或拍击式均质器拍
9、击2 min，制备成1；10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌容器内，加225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。52增菌521定性检测将上述l：10稀释液于36士1培养8 h18 h。2GBT 478972008522定量检测5221用灭菌吸管吸取1：10稀释液1 mL，注入含有9 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1：100的稀释液。5222另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。5223根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有
10、9 mL3氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL。置36C1恒温箱内，培养8 h18 h。53分离531在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于36士1培养18 h24 h。532典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快(不超过1 h)挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2 mm3 mm。54纯培养挑取三个或以上可疑菌
11、落，划线3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36C士1培养18 h24 h。55初步鉴定551 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。552涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。553挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36C土1培养24 h观察结果。副溶血性弧菌在3氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。554嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水，36IC培养24 h，观
12、察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7氯化钠的胰胨水中生长旺盛。56确定鉴定561生化试验：取纯培养物分别接种含3氯化钠的甘露醇、赖氨酸、MR-VP培养基，36*(21培养24 h48 h后观察结果。隔夜培养物进行ONPG试验。562 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK鉴定。57报告当检出的可疑菌落生化性状符合表1要求时，报告25 g(mL)样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧茵阳性的试管管
13、数，查最可能数(MPN)检索表，报告每克(毫升)副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。表1 副溶血性弧菌的生化性状试验项目 结 果革兰氏染色镜检 阴性，无芽孢氧化酶 +动力 +蔗糖GBT 478972008表1(续)试验项目 结 果葡萄糖 +甘露醇 +分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶 +V PoNPG注：+阳性；一阴性。表2副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别D一 嗜盐性试验氧 赖 精 鸟 明 脲 42 蔗 纤 乳阿 D一 D一 O名 称 化 氨 氨 氨 VP 生 维拉 甘 甘 N 氯化钠含量酶 酸 酸 酸 胶 酶 长 糖 二 糖 伯 露 露P糖 糖 醇 G
14、0 3 6 8 10糖副溶血性弧菌+ + + + V + V + + + + + +Vparahaemolyticus刨伤弧菌+ + + + + + + 上 V + + +VvulniCU$溶藻弧苗+ + + + + + 上 + + + + + +valgino，ticks霍乱弧菌+ + + + V + + + + + + +Vcholerae拟态弧菌+ + + + + + + + + +矿mimicus河弧苗+ + + V + + + + + + + + Vy疗“口iaZ2，弗氏弧菌+ + + + + + 牟 + + + +Vfurnissii梅氏弧菌+ + + + V + + + + +
15、+ V矿metschnikovii霍利斯弧菌+ nd + + + +Vhollisae注：nd表示未试验；V表示可变。6血清学分型(可选择)61制备：接种两管3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36C土1C培养18 h24 h。用含3氯化钠的5甘油溶液冲洗3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。62 K抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再4GBT 478972008用单个的抗血清进行检测。用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴茵悬液，并加一滴相当的K血清。在对照问隔内加一滴3氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，
16、使各成分相混合，再前后倾动玻片1 rain。阳性凝集反应应可以立即观察到。63 0抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121灭菌1 h。灭菌后4 000 rmin离心15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4 000 rrain离心15 rain，最后一次离心后留少许上层液体，将细胞浆弹起制成菌悬液。用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 rain。阳性凝集反应应可以立即观察到。如果未见到与0群血清的凝集反应，将菌悬液121再次高压I
17、h后，重新检测。如果仍旧为阴性，则培养物的0抗原属于未知。根据表3报告血清学分型结果。表3副溶血性弧菌的抗原O群 K 型1 1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，692 3，283 4，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，754 4，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，735 15，17，30，47，60，61，686 18，467 198 20，21，22，39，41，70，749 234410 24，711l 19，36，40，46，50，5l，611
18、2 19，52，61，6613 657神奈川试验神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关。用接种环将测试菌株的3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18 h培养物点种表面干燥的我妻氏血琼脂平板。每个平板上可以环状点种几个菌。36*(21培养不超过24 h，并立即观察。阳性结果为菌落周围呈半透明环的p溶血。GBT 478972008A1 3氯化钠碱性蛋白胨水(APw)附录A(规范性附录)培养基和试剂A11成分蛋白胨loo g氯化钠 30o g蒸馏水 1 oooo mLpH 854-02A12制法将上述成分混合，121。C高压灭菌10 rain。A
19、2硫代硫酸盐一柠檬酸盐一胆盐一蔗糖(TCBS)琼脂A21成分多价蛋白胨酵母浸膏柠檬酸钠(c6H507Na32H：O)硫代硫酸钠(Na：S：O。5H。O)氯化钠牛胆汁粉柠檬酸铁胆酸钠蔗糖溴麝香草酚蓝麝香草酚蓝琼脂蒸馏水A22制法100 g50 g100 g100 g100 g50 g10 g30 g200 g004 g004 g150 g1 0000mL加热煮沸至完全溶解，最终的pH应为864-02。冷至50C倾注平板备用。A3 3氯化钠胰蛋白胨大豆(TSA)琼脂A31成分胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水A32制法150 g50 g300 g150 g1 0000InL将上述成分混合，加热并轻
20、轻搅拌至溶解，121 0C高压灭菌15 rain，调节pH至734-02。6A4 3氯化钠三糖铁(TSI)琼脂A41成分蛋白胨月示蛋白胨牛肉膏酵母浸膏氯化钠乳糖蔗糖葡萄糖硫酸亚铁(FeSO。)苯酚红硫代硫酸钠(Na。S：O。)琼脂水A42制法150 g50 g3O g30 g300 g10，O g100 g1O g02 g0024 g03 g120 g1 0000 InLGBT 478972008调节pH，使灭菌后为74=k02。分装到适当容量的试管中。121高压灭菌15rain，制成斜面，斜面长4 cm5 cm，底部深度为2 cm3 cm。A5嗜盐性试验培养基A5，1成分胰蛋白胨氯化钠蒸馏水
21、PH 72土02A52制法100 g按不同量加入1 000OmL配置胰蛋白胨水，校正pH，共配制四瓶，每瓶100 mL。每瓶分别加入不同量的氯化钠：(1)不加(2)3 g；(3)6 g；(4)10 g。121(2高压灭菌15 rain，在无菌条件下分装试管。A6 3氯化钠甘露醇试验培养基A61成分牛肉膏蛋白胨氯化钠磷酸氢二钠(Naz HPO。12H。O)02溴麝香草酚蓝溶液蒸馏水pH 74A62制法将上述成分配好后，分装每瓶100 mL，121高压灭菌15 rain。另配10甘露醇溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管，7g砒gOgg0m啪肌眦绷渤
22、GBT 478972008A63试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36-t-1培养不少于24 h，观察结果。甘露醇阳性者培养物呈黄色，阴性者为紫色。A7 3氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A71成分蛋白胨 50 g酵母浸膏 30 g葡萄糖 10 g蒸馏水 1 0000mL16溴甲酚紫一乙醇溶液 10 mL卜赖氨酸05 g100 mL或10 g100 mL氯化钠 300 g水 1 0000 mLA72制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100 mL，校正pH至68。再按05的比例加入赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。分装于灭菌的小试管内，每管05 mL，上面滴加一层液体石蜡，115(2高压灭菌
23、10m11。A73试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36土1。C培养不少于24 h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A8 3氯化钠MR-VP培养基A81成分多胨 70 g葡萄糖 50 g磷酸氢二钾(K：HPO。) 50 g氯化钠 300 g蒸馏水 1 0000mLpH 695_O。2九82制法将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121C高压灭菌15 min。九9我囊氏血琼脂A91成分酵母浸膏 30 g蛋白胨 100 g氯化钠 700 g磷酸氢二钾(KsHPn) 50 g甘露醇 100 g
24、结晶紫0001 g琼脂 150 g8蒸馏水pH 80土02A92制法1 0000 1TlLGBT 478972008将上述成分混合，加热至100。C，保持30 min，玲至46(250C，与50 mL预先洗涤的新鲜人或兔红细胞(含抗凝血剂)混合，倾注平板。彻底干燥平板，尽快使用。A10氧化酶试剂A101试剂A1011 1盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。A1012 1*萘酚一乙醇溶液。A102试验方法A1021取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加a一萘酚一乙醇溶液一滴，阳性者于05 min内呈现鲜蓝色。阴性于2 rain
25、内不变色。A1022以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。A11革兰氏染色液A1，1结晶紫染色液A111，1成分结晶紫 10 g95乙醇 200 mL1草酸铵水溶液800 mLA1112制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A112革兰氏碘液A1121成分碘 10 g碘化钾 20 g蒸馏水 3000mLA1122制法将碘与旗化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A113沙黄复染液A1131成分沙黄025 g95乙醇 100mL蒸馏水 900mLA1132制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A114染色法a)将涂
26、片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。b)滴加革兰氏碘液，作用1 rain，水洗。c)滴加95乙醇脱色，约15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d)滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。9GBT 478972008A12 ONPG试剂A121缓冲液A1211成分磷酸二氢钠(NaH。PqHzo)用蒸馏水加至A1212制法69 g500mL将磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，调节pH值至70。缓冲液置冰箱保存。A122 ONPG溶液A1221成分邻硝基酚母n半乳糖苷(ONPG)008 g蒸馏水 150mL缓冲液 50mLA1222制法将ONPG在37的蒸馏水中
27、溶解，加入缓冲液。ONPG溶液置冰箱保存，试验前，将所需用量的ONPG溶液加热至37。A123 3氯化钠溶液A1231成分氯化钠蒸馏水A1232制备300 g1 0000 mL将氯化钠溶于蒸馏水中，121。C高压灭菌20 min。A124试验方法将待检培养物接种3氯化钠三糖铁琼脂，361培养18 h。挑取1满环新鲜培养物接种于0，2：5 mL 3氯化钠溶液，在通风橱中，滴加l滴甲苯，摇匀后置37 4C水浴5 rain。加025 mL ONPG溶液，36C土1培养观察24 h。阳性结果呈黄色，阴性结果则24 h不变色。A13 Voges-Proskauer(V-P)试剂A131成分甲液：一萘酚
28、50 g无水乙醇 1000 mL乙液：氢氧化钾 400 g用蒸馏水加至 1000 mLA132试验方法将3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种3氯化钠MRVP培养基，36土1培养48 h。取l mL培养物，转放到一个试管内，加06 mL甲液，摇动。加02 mL乙液，摇动。随意加一点肌酸结晶，4 h后观察结果。阳性结果呈现伊红的粉红色。附录B(规范性附录)1 g(mL)检样中最可能数(MPN)检索表1 g(mL)检样中最可能数(MPN)检索表见表B1。表B1 1 g(mL)检样中最可能数(MPN)检索表GBT 478972008阳性管数 95可信限 阳性管数 95可信限MPN MPN0 10 o01 oOOl 下限 上限 o10 oOl oOOl 下限 上限O 0 O 1loo 420注1：本表采用3个稀释度Eo1 g(mL)、001 g(mL)和0001 g(mL)，每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用1 g(mL)、01 g(mL)和001 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用001 g(mL)、0001 g(mL)、0000 1 g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。
