1、ICS 0710030C 53 园酉中华人民共和国国家标准GBT 478982008代替GBT 47898 2003食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验20081 1-21发布Microbiological examination of food hygiene-Examination of Yersinia eHferocDffffc口2009-03-0 1实施宰裂瀑蕹稿茹篓发布中国国家标准化管理委员会促1”刖 昌GBT 478982008本标准代替GBT 478982003(食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验。本标准与GBT 47898 2003相比主要修改如下：操作步
2、骤61中4冰箱冷增菌改为261，48 h72 h；操作步骤67生化鉴定增加了：API 20E和VITEK GNI一；增加了附录A“培养基和试剂”。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：江苏省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位：浙江省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、南京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：袁宝君、刘秀梅、戴建华、沈赞、梅玲玲、廖兴广、祝长青、陈晓蔚、田静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 4789
3、8 1 984、GBT 478981 994、GBT 47898 2003。1范围食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GBT 478982008本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Uersinia enterocolitica)的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 4789
4、4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验3设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：31冰箱：25 oC。32恒温培养箱：261、36士1。33显微镜：10100。34均质器或灭菌乳钵。35天平：感量01 g。36灭菌试管：16 mm1 60 miTt、15 mm100 miTt。37灭菌吸管：1 mL(具001 mI。刻度)、10 mI。(具01 mI。刻度)。38灭菌锥形瓶：200 mI一500 mI，。39灭菌培养皿：直径90 film。310全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK”。4培养基和试剂41 改良磷酸盐缓冲液：见第A1章。42 CIN 1培养基：见第A2章。43
5、改良Y培养基：见第A3章。44改良克氏双糖培养基：见第A4章。45糖发酵管：见第A5章。46鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A6章。47半固体琼脂：见第A7章。48缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和V P试验用：见第A8章。4。9碱处理液：见第A9章。410尿素培养基：见第A10章。41 1 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡”。) 由法国生物梅里埃公司提供的产品商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GBT 4789820085检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1 小肠结肠
6、炎耶尔森氏菌检验程序6操作步骤61增菌以无菌操作称取25 g(或25 mL)样品放人含有225 mI改良磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均质袋GBT 478982008中，以8 000 rrain均质1 rain或拍击式均质器均质l min。液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。于26l增菌48 h72 h。62碱处理除乳及其制品外，其他食品的增菌液O5 mI。与碱处理液45 mL充分混合15 S。63分离将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN】琼脂平板和改良Y琼脂平板，于261培养48 h2 h，典型菌落在CIN 1琼脂平板上为红色牛眼状菌落，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不牯稠
7、的菌落。64改良克氏双糖试验分别挑取上述可疑菌落3个5个，接种改良克氏双糖斜面，于261培养24 h，将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。65尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，于261培养2 h4 h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于261和36土l恒温培养箱中培养24 h。将26有动力的可疑菌落接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色和生化试验。66革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(o8 pm30 pm)08“m。67生化鉴定671常规生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取单
8、个菌落做生化试验，所有的生化反应皆在261培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特性以及与其他菌的区别见表1。表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表小肠结肠炎 中间型耶 弗氏耶 克氏耶 假结核 鼠疫耶耶尔森氏菌 尔森氏菌 尔森氏菌 尔森氏菌 耶尔森氏菌 尔森氏菌项 目Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersiniarederiksen z 2 pseudotuberculosis动力(26) + + 土 +尿素酶 + 上 + +vP试验(26) + 上 +鸟氨酸脱羧酶 + + 斗 +蔗糖 d + +棉子糖 + d山梨醇 +
9、 + +甘露醇 + + + + +鼠李糖 + + +注：+阳性；一阴性；d有不同生化型。672生化鉴定系统可选择使用两种生化鉴定系统(APl 20E或VIFEK GNI一)中任一种，代替常规的生化鉴定。6721 API 20E：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照API 20E操作手册进行并判读结果。6722 VITEK全自动细菌生化分析仪：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照VITEK GNI+操作手册进行并判定结果。3GBT 47898200868血清型鉴定除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。具体操作方法按GBT 47894中沙门氏菌O因子血清分型。7结果报告综合以上生化特性报告结果，报告2
10、5 g(或25 m1)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。4附录A(规范性附录)培养基和试剂GBT 478982008A1 改良磷酸盐缓冲液A11成分磷酸氢二钠(Na。HPO。)823 g磷酸二氢钠(NaH2POtH20) 12 g氯化钠(NaCl) 50 g三号胆盐 15 g山梨醇 20 gA12制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加入三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH为76，分装试管，于121高压灭菌15 rain，备用。A2 CIN一1培养基A21基础培养基：胰胨酵母浸膏甘露醇氯化钠去氧胆酸钠硫酸镁(MgSOa7H20)琼脂蒸馏水pH7501将基础培养基于121高压灭菌15 rain，
11、备用。A22 1rgasan：以95的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成04的溶液，待基础培养及冷至80时，加入1 mL混匀。A23冷至50时，加入：中性红(3 mgmI) 100 mI一结晶紫(O1 mgmI，) 100 mL头孢菌素(15 mgmI。) 】00 mL新生霉素(025 mgmI。) 100 mL最后不断搅拌加入100 mI。的10氯化锶，倾注平皿。A3改良Y培养基A31成分蛋白胨氯化钠乳糖草酸钠150 g50 g100 g20 ggggg“gogg1o“0O0O0OO2522212O19GBT 478982008去氧胆酸钠三号胆盐丙酮酸钠孟加拉红水解酪蛋白琼脂蒸馏水A32制法将上述
12、成分混合，校正pH7A4改良克氏双糖培养基A41成分蛋白胨牛肉膏酵母膏山梨醇葡萄糖氯化钠柠檬酸铁铵硫代硫酸钠琼脂酚红蒸馏水pH74A42制法60 g50 g2o g40 mg50 gl 7 g1 000 mI，401。于12l高压灭菌1 5 rain，待冷至45左右时，倾注平皿。20 gJ g0 g20 gl g0 g0，5 g05 g12 g0025 g1 000 mI将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中匀，分装试管，装量宦多些，以便得到比较高的底层。A5糖发酵管A51成分校正pH。加入002的酚红水溶液125 mI。，摇121高压灭菌1 5 min，放置高层斜面备用。牛肉膏 5 g蛋白
13、胨 10 g氯化钠 3 g磷酸氢二钠(Na：HPO。12H：() 2 g02溴麝香草酚蓝溶液 12 mI蒸馏水 1 000 mI。pH74A52制法A521葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按05加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15 rain。A522其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mI。，121高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好lo溶液，同时高压灭菌。将5 mI。糖溶液加入100 m1培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。6GBT 478982008A53试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于2
14、61培养，一般观察2 d3 d。迟缓反应需观察14 d30 d。A6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基A61成分蛋白胨酵母浸膏葡萄糖蒸馏水16溴甲酚紫一乙醇溶液I，鸟氨酸或DL一鸟氨酸pH68A62制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后，分装，每瓶100 mL，分别加入鸟氨酸。I。鸟氨酸按05加入，DL鸟氨酸按1加入。再校正pH至68。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内，每管05 mL，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭菌10 min。A63试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于26土1培养18 h24 h，观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基
15、变为黄色。对照管为黄色。A7半固体琼脂A71成分蛋白胨 1 g牛肉膏03 g氯化钠05 g琼脂035 g04 g蒸馏水 100mLpH74A72制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管，121高压灭菌15 rain，直立凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。A8缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P试验用)A81成分磷酸氢二钾 5 g多胨 7 g葡萄糖 5 g蒸馏水 1 000 mLpH70A82制法溶化后校正pH，分装试管，每管1 mL，121高压灭菌1 5 min。LmOg或Lm，O谳加。札瑰；110GBT 478982008A83 甲基红(MR)试验自琼脂斜
16、面挑取少量培养物接种本培养基中，于261培养2 d5 d，哈夫尼亚菌则应在2225培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：lo mg甲基红溶于30 mI，95乙醇中，然后加入20 mI蒸馏水。A84 VP试验用琼脂培养物接种本培养基中，于261培养2 d-4 d。哈夫尼亚菌则应在2225培养。加入6a一萘酚乙醇溶液05 mI和40氢氧化钾溶液02 mI。，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在361培养4 h再进行观察。A9碱处理液A91 0，5氯化钠溶液氯化钠蒸馏水A92 05氢氧化钾溶液氢氧化钾蒸馏水A93制法05 g】00mI。05 g100mL将05氯化钠及05氢氧化钾等量混合。A10尿素培养基A101成分尿素 200 g酵母浸膏01 g磷酸二氢钾(KH。PO；)009l g磷酸氢二钠(Na。HPO。)0095 g酚红001 g蒸馏水 1 000 mI。A102制法 将上述成分于蒸馏水中溶解，校正pH为6802。不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管为约3mL。A103试验方法挑取琼脂培养物接种在尿素培养基，261培养24 h。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
