1、ICS 0710030C 53 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 478992008代替GBT 47899200320081 1_21发布食品卫生微生物学检验空肠弯曲茵检验Microbiological examination of food hygiene-Examination of Campylobacter jejuni20090301实施丰翟戮篓发布中国国家标准化管理委员会“。刖 吾GBT 478992008本标准的第一法修改采用ISO 102721：2006食品和动物饲料的微生物学检验和计数弯曲菌的等同方法第l部分：检验方法(Microbiology of food and ani
2、mal feeding stuffsHorizontal methodfor detection and enumeration of Campylobacter spp Part 1：Detection method)。本标准的第一法与ISO 102721：2006的主要区别如下：删除了规范性引用文件、术语和定义、检验原理；增加并完善了各类样品的处理、增菌培养；增加了Skirrow琼脂与01蛋白胨水。本标准代替GBT 47899 2003食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验。本标准与GBT 47899 2003相比主要修改如下：删除了规范性引用文件；一修改并完善了操作步骤；增加了弯曲菌的酶联荧
3、光免疫检验方法作为筛选检验法；删除了生物分型、血清分型、菌株保存与注意事项的内容；增加了附录A“培养基与试剂”。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位：河南省疾病预防控制中心、江苏省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：蒋原、刘秀梅、祝长青、郭云昌、廖兴广、栾军、袁宝君、程苏云、田静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 47899 1 984、GBT 47899 1 994、GBT 47
4、899 2003。1范围食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验本标准规定了食品中空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中空肠弯曲菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：21冰箱：28。22恒温培养箱：25l，364-1，42l。23恒温振荡培养箱：36l，421。24水浴装置：361，100。25微需氧培养装置：提供微需氧条件(5氧气、10二氧化碳和85氮气)。26均质器。27电子天平：感量01 g。28过滤装置及滤膜(022”m，045 pm)。29显微镜：10100，有相差功能。210离心机：离心力
5、20 000g。211 全自动微生物鉴定系统(VITEK 2)”。212伞自动酶联荧光免疫分析仪(VIDAS或mini V1DAS)”。3培养基和试剂31 Bolton j=i3汤：按第A1章规定。3，2改良CCD(mCCD)琼脂；按第A2章规定。33哥伦比亚琼脂：按第A3章规定。34布氏肉汤：按第A4章规定。35氧化酶试剂：按第A5章规定。36马尿酸钠水解试剂：按第A6章规定。37 Mueller Hinton琼脂：按第A7章规定。38吲哚乙酸酯纸片：按第A8章规定。39 Skirrow琼脂：按第A9章规定。310 01蛋白胨水：按第A，10章规定。311 CFA显色平板”。312 1 mo
6、lI，碳酸氧钠(NaHCO。)溶液。313 3过氧化氢溶液。314 API Campy生化鉴定试剂盒”。315 V1FEK 2 NH生化鉴定”。GBT 478992008由法同生物梅里埃(bioMerieux)公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对设产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果则可使用这些等效的产品。1GBT 4789920084检验程序空肠弯曲菌检验程序见图1。第一法 常规培养法图1 空肠弯曲菌检验程序5操作步骤51样品处理511一般样品取25 g(或25 mI。)样品(水果、蔬菜、水产品为50 g)加入盛有100 mI。Bolton肉汤的有滤
7、网的均质2GBT 478992008袋中(无滤网的均质袋可使用无菌纱布过滤)，用拍击式均质器均质1 min2 min；或加人盛有100 mI。Bolton肉汤的均质杯中，以8 000 rmin10 000 rrain均质1 min2 min，经滤网或无菌纱布过滤。将滤液进行培养。512鲜乳、冰淇淋、奶酪等取50 g样品加人盛有50mI，01蛋白胨水的有滤网均质袋中，必要时调整pH值至7202，用拍击式均质器均质1 5 s30 S，将滤液以20 000g离心30 min后弃去上清，用10 m1Bolton肉汤悬浮沉淀(尽量避免带人油层)，再转移至90mI，不舍抗生素的Bolton肉汤进行培养。5
8、13贝类取至少1 2个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质l min2 rain，取25 g样品于225 mI。Bolton肉汤中(1：lo稀释)，再转移25 mI。225 mL Bolton肉汤中(1：100稀释)，将1：10和1：100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。514蛋黄液或蛋浆取25 g(或25 mL)样品于125 mI，Bolton肉汤中并搅匀(1：6稀释)，再转移25 mL100 mLBolton肉汤中并搅匀(1：30稀释)，同时将1：6和1：30稀释的Bolton肉汤进行培养。515整禽等样品用200 mI。01的蛋白胨水充分冲洗样品的内外部，
9、并振荡2 min3 min，经无菌纱布过滤至250mI。离心管中，16 000g离一tbl5min后弃去上清，用10mL 01蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3 mI，100 mI，Bolton肉汤中进行培养。516需表面涂拭检测的样品无菌棉签涂布样品表面(面积为50 cm2100 crfl2)，将棉签头剪落到100 mIBolton肉汤中进行培养。517水样将4 L的水(对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5 m11 molL硫代硫酸钠溶液)经045 pm滤膜过滤，将滤膜浸没在100 ml。Bolton肉汤中进行培养。52预增菌与增菌在微需氧条件下，以100 rmin的振荡速度，36l培养4 h。必要
10、时测定增菌液的pH值并调整至7202。421继续培养48 h。53分离将24 h增菌液、48 h增菌液以及相应的l：50稀释液分别划线接种于Skirrow与mCCD琼脂平板上，微需氧条件下421培养24 h48 h。另外，可同时选择使用CFA显色平板。观察24 h培养与48 h培养的琼脂平板上的菌落形态。mCCD琼脂平板上的可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向，直径约为1 mm2 iilnl。Skirrow琼脂平板上的可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；有些可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，直径约为1 mm2 mm，边缘整齐、发亮。CFA显色平板上的可疑菌落为
11、红色、突起、湿润，菌落直径约为2 mm3 Film，边缘有一圈红色的透明环，中间有一个圆形的、不透明、颜色较深的红色小点的菌落。54鉴定541弯曲菌属的鉴定挑取5个或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下42士1培养24 h48 h，按照54115415进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。GBT 478992008表1弯曲菌属的鉴定项 目 弯陆菌属特性革兰氏阴性，菌体弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形、形态观察螺旋状或海鸥展翅状。动力观察 呈现螺旋状运动“氧化酶实验 阳性微需氧条件下251生长试验 不生长有氧条件下421生长实验 不生长。有些菌株的形态不典型。o
12、有些菌株的运动不明显。5411形态观察挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。5412动力观察挑取可疑菌落用1 mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。5413氧化酶试验用铂铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。5414微需氧条件下251生长试验挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下25l培养44 h4 h，观察细菌生长情况。5415有氧条件下421生长试验挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，有氧条件下42l培养44 h4 h，观察细菌生长情况。542空肠弯曲菌的鉴定5421过氧化氢酶试验：挑取菌落，加到干净玻片
13、上的3过氧化氢溶液中，如果在30 S内出现气泡则判定结果为阳性。5422马尿酸钠水解试验：挑取菌落，加到盛有04 mI。1马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在361水浴放置2 h或361培养箱中放置4 h。沿着试管壁缓缓加入02 ml。茚三酮溶液，不要振荡，在36l的水浴或培养箱中放置10 rain后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。5423吲哚乙酸酯水解试验：挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上，再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5 rain 10 min内出现深蓝色；若无颜色变化则没有发生水解。5424药物敏感性试验(可选择)：挑取菌落，在布氏肉汤中制备
14、成浓度为05 McFarland的菌悬液，再用布氏肉汤制备1：10的稀释液，在5Mueller Hinton琼脂平板上进行涂布，静置5 min后去除多余液体，将平板在361培养箱中放置10min进行干燥。将头孢霉素(30 ug)和萘啶酮酸(30 gg)药敏纸片放在琼脂表面。将平板在微需氧条件下361培养22 h2 h。如果细菌紧贴着纸片生氏则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感。空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。表2空肠弯曲菌的鉴定GBT 478992008空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 海鸥弯曲菌 乌普萨拉弯曲菌牲 征tC|。lunil (C col) (C lar r) (C ups
15、aliensis)过氧化氢酶试验 + + + 一或微弱马尿酸盐水解试验 +吲哚乙酸酯水解试验 + +头孢菌素敏感试验 R R R S萘啶酮酸敏感试验 9 S8 RS6 S注：+阳性； 阴性；S敏感；R抗性。8空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对萘啶酮酸的耐药性呈现出增长趋势。b海鸥弯曲菌的不同菌株分别表现为敏感或抗性。5425对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用API Campy生化鉴定试剂盒或V1TEK 2 NH生化鉴定卡来替代542145424的鉴定，具体操作按照产品说明书进行。55结果报告综合以上试验结果，报告检样单位中检出空肠弯曲菌或未检出空肠弯曲菌。第二法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法6原理弯曲菌
16、的酶联荧光免疫筛选法是在全自动酶联荧光免疫分析仪上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫检验方法。固相容器(SPR)用抗弯曲菌抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔，在特定时问内样本在SPR内外反复循环，使得弯曲菌抗原与包被在SPR内部的弯曲菌抗体结合，洗涤去除未结合的其他成分。接着标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SPR壁上的弯曲菌抗原相结合，洗去未结合的抗体标记物。结合在SPR壁上的碱性磷酸酶将催化底物磷酸4甲基伞型物转变成具有荧光的4一甲基伞形酮，以450 nm波长处检测荧光强度，由仪器分析后得出检验结果。7仪器mini VIDAS或VIDAS。8试剂81 弯曲菌试剂条(VII
17、)AS CAM)。82校正液：纯化灭活的弯曲菌抗原标准溶液。83阳性对照。84阴性对照。85 MI，E卡。9操作步骤91增菌液处理取1 mI。24 h培养的Bolton增菌液加入试管中，100水浴1 5 min。剩余增菌液继续培养至48 h。5GBT 47899200892仪器操作9，21输入MLE卡信息每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MI。E卡向仪器输入试剂规格(或曲线数据)。每盒试剂只需输入一次。922校正在输入MI。E卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正应做双份测试。以后每】4 d进行一次校正。93检测取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。建立工作表格，输入样本编号。分
18、别吸取500 pI，阴性、阳性对照和样本(冷却至室温)加入到试剂条样本L中央。依照屏幕提示，将VIDAS CAM试剂条放人仪器的相应位置。所有分析过程由仪器自动完成。94结果报告941检测值(x)是样品的相对荧光值(RFV，)与标准溶液的相对荧光值(RFV。)的比值，见式(1)。x一罴 (1)若检测值o10，则检测结果为阴性；若检测值010，则检测结果为阳性。942检测结果阴性，可直接报告检验单位中未检出空肠弯曲菌。检测结果阳性的样品，应按照5354对剩余增菌液进行确认并报告。附 录A(规范性附录)培养基与试剂A1 Bolton肉汤(Bolton broth)A11基础培养基A111成分动物组
19、织酶解物(enzymatic digest of animal tissues)乳白蛋白水解物(1actalbumin hydrolysate)酵母浸膏氯化钠丙酮酸钠偏亚硫酸氢钠碳酸钠a酮戊二酸水A112制法用水溶解基础培养基成分，如需要可使用加热促其溶解。12l灭菌1 5 min。100 g50 g50 g50 g05 g05 g06 g10 g1 000 mLGBT 478992008将基础培养基分装至合适的锥形瓶内A12 无菌裂解脱纤维绵羊或马血对无菌脱纤维绵羊或马血通过反复冻融进行裂解或使用皂角苷进行裂解。A13抗生素溶液A131成分头孢哌酮(cefoperazone)002 g万古霉
20、素(vancomycin)002 g三甲氧苄胺嘧啶乳酸盐(trimethoprim Lactate)002 g两性霉素B(amphotercin B)0ol g多粘菌素B(polymyxin B)001 g乙醇灭菌水(5050，体积比) 5 mI。A132制法将上述成分溶解于乙醇灭菌水混合溶液中。A14完全培养基A141成分基础培养基(A1】) l 000mL无菌裂解脱纤维绵羊或马血(A12) 50mI抗生素溶液(A13) 5 mI。A142制法当基础培养基的温度约为45左右时，无菌加入绵羊或马血和抗生素溶液，混匀，将完全培养基的pH值调至7202(25)，将培养基无菌分装至合适的试管或锥形瓶
21、中备用。配制的增菌液在常温下放置不得超过4 h，或在4左右避光保存不得超过7 d。7GBT 478992008A2改良CCD琼脂(modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar，mCCDA)A21基础培养基A211成分肉浸液动物组织酶解物氯化钠木炭酪蛋白酶解物去氧胆酸钠硫酸亚铁丙酮酸钠琼脂水A212制法用水溶解基础培养基成分，煮沸。A22抗生素溶液A221成分头孢哌酮(cefoperaz。ne)分装至合适的三角瓶内，121高压灭菌15 min。两性霉素B(amphotericin B)利福平(rifampicin)乙醇灭菌水(50so，体积比)
22、A222制法将上述成分溶解于乙醇灭菌水混合溶液中。A23完全培养基A231成分基础培养基(A21)抗生素溶液(A22)A232制法0032 g001 g001 g5 mL1 000 mI，5 mL当基础培养基的温度约为45左右时，加入抗生素溶液，混匀。将完全培养基的pH值调至7202(25)。倾注约15 mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 rain，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4左右冷藏不得超过7 d。A3哥伦比亚琼脂(Columbia blood agar)A31基础培养基A3
23、11成分动物组织酶解物淀粉氯化钠琼脂水8230 g10 g50 g80 g1 80 g1 000 ml。呱呱。盹旷叭c=呱吣呱呱弱踮呱姗加m曩乱文L吼吼&，GBT 478992008A312制法将基础培养基成分溶解于水中，加热促其溶解。分装至合适的三角瓶内，121高压灭菌1 5 rain。A32无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 rain，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A33完全培养基A 331组分基础培养基(A31)无菌脱纤维绵羊血(A32)A332制法1 000 mI50 mI当基础培养基的温度为45左右时，无菌加入绵羊血，混匀。将完全培养
24、基的pH值调至7202(25)。倾注1 5 1111。于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 rn Jn，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4左右冷藏不得超过7 d。A4布氏肉汤(Brucella broth)A41成分酪蛋白酶解物 100 g动物组织酶解物 100 g葡萄糖 10 g酵母浸膏 20 g氯化钠 50 g亚硫酸氢钠01 g水 1 000 mI。A42制法将基础培养基成分溶解于水中，如需要可加热促其溶解。将高压灭菌后培养基的pH值调至7002(25)。将培养基分装至合适的试管中，每
25、管10 mL，121高压灭菌15 rain。A5氧化酶试剂(reagent for the detection of oxidase)A51成分四甲基对苯二胺盐酸盐(N，N，N，Ntetramethyl 1，4-phenylenediamine djhvdrochloride)蒸馏水A52制法1，0 g100 mI，使用前迅速将上述成分溶于水中。A6 马尿酸钠水解试剂(reagents for the detection of hydrolysis of hippurate)A61马屎酸钠溶液A611成分马尿酸钠 100 g磷酸盐缓冲液(PBS)组分：氯化钠(NaC)磷酸氢二钠(Na。HPO。
26、2H。O)85 g898 gGBT 478992008磷酸二氢钠(NaH2PO。H20)蒸馏水A612制法将马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中，过滤除菌。一20A62 35(水合)茚三酮溶液(质量体积)A621成分(水合)茚三酮(nin hydrin)丙酮丁醇A622制备将(水合)茚三酮溶解于丙酮丁醇混合液中。271 gl 000 rflI。用合适的试管进行无菌分装，每管04 mI，储存于175 g25 mI。25 mI。该溶液在避光冷藏时最多不超过7 d。A7 Mueller Hinton琼脂(Mueller Hinton blood agar)A71基础培养基A711成分动物组织酶解物 60 g
27、酪蛋白酶解物 175 g可溶性淀粉 15 g琼脂80 g180 g水 1 000 mI，A712制法将基础培养基成分溶解于水中，煮沸。将基础培养基分装于合适的三角瓶中，121高压灭菌1 5 min。A72无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A73完全培养基A731成分基础培养基(A71) 1 000 mI无菌脱纤维绵羊血(A72) 50 mIA732制法当基础培养基的温度约为45左右时，无菌加入绵羊血，混匀。根据需要，将完全培养基的pH值调至72o2(25)。倾注约15 mL于灭菌平皿中，静置至培养基凝固。
28、使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4左右冷藏不得超过7 d。A8 吲哚乙酸酯纸片(indoxyl acetate disc)A81成分吲哚乙酸酯丙酮A82制法将吲哚乙酸酯溶于丙酮中1 001 g1 ml，吸取25“I。50*L溶液于空白纸片上(直径为06 cm12 cm)。室温干燥，用带有硅胶塞的棕色试管(瓶)于4保存。A9 Skirrow琼脂(Skirrow agar)A91基础培养基A911成分蛋白胨胰蛋白胨酵母浸膏氯化钠琼脂水A912制法150 g25 g50 g50 g
29、150 g1 000 InLGBT 478992008将基础培养基成分溶解于水中，加热并搅拌促其溶解，121高压灭菌1 5 min。A92 FBP溶液A921成分丙酮酸钠025 g焦亚硫酸钠025 g硫酸亚铁025 g蒸馏水 5 mLA922制法将各成分溶于100 mI水中，经022,um滤膜过滤除菌。FBP最好根据需要量现用现配，在一70储存不超过3个月或一20储存不超过1个月。A93抗生素溶液A931成分头孢哌酮(cefoperazone)0032 g两性霉素B(amphotericin B)001 g利福平(rifampicin)001 g乙醇灭菌水(5050，体积比) 5 mLA932
30、制法将上述成分溶解于乙醇灭菌水混合溶液中。A94无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A95完全培养基A951成分基础培养基(A91) l 000 mLFBP溶液(A92) 5 mL抗生素溶液(A93) 5 mI。无菌脱纤维绵羊血(A94) 50 mI。A952制法当基础培养基的温度约为45左右时，加入FBP溶液、抗生素溶液与冻融的无菌脱纤维绵羊血，混匀。将完全培养基的pH值调至7202(25)。倾注约1 5 mI。于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表GBT 478992008面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4左右冷藏不得超过7 d。A10 01蛋白胨水A101成分蛋白胨 10 g水 1 000 mI。A102制法溶解蛋白胨于水中，将pH值调至70士02(25)，1 21高压灭菌l 5 min。
