1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GBjT 5009.111-2003 代替GB/T14929.5-1994 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定2003-08-11发布Determination of deoxynivalenol in cereal and cereal products 2004-01-01实施中华人民共和国卫生毁发布中国国家标准化管理委员耐GB/T 5009.111一200352 前言本标准代替GB/T14929.5-1994谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法儿本标准与GB/T14929.5-1994相比主要修改如下s一一修改了标准的中文名
2、称，标准中文名称改为d谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定闪一一按GB/T20001. 4-2001标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位g卫生部食品卫生监督检验所。本标准第一法主要起草人:魏润蕴。本标准第二法主要起草人=阳传和、罗雪云、计融。原标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。GB/T 5009.111-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀商烯酶的测定1范lI!l本你准规定了谷物及其1IltJ品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀商烯醇DON、nl区吐毒案)的薄层色谱测定方法及免疫测定方法(ELISA)。
3、本标准运珞子谷物小米、玉米、大麦等及其苦毒品(蛋糕、饼干、黯包等)中放辈革笃草草镰刀蕾烯醇(DON、呕吐毒素的测定。本标准第一法检tll恕。.1mg/烛，第二法检出限为。.1ng/kg. 第一法薄层包谱测定法2原臻谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀黯烯董事级提取、净化、浓缩寻站在去胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板的沁人了三氯化铝，使脱氧量雪腐镰刀烯董事在365nm紫外光灯下豆豆蓝色荧光，与标准比较。3试弗j3.1 三氯甲烧。3.2 元水乙董事。3.3 甲瓣。3.4 石涵盖盖60C创辈辈3扩C60C也3.5 乙股乙酿。3.6 乙腾-3.7 苑露露.3.8 界的问自事。3.9 乙撼。3.10
4、 ;j盐水乙重量。3.11 氯化铝(AICI，叶子f，O):化学纯。3.12 中性氧化然:f.罢新炼，经300CI吉化4扭，登干燥器中备用。3.13 活性炭:20g活性炭，用3mollL辈辈酸溶液浸泡过夜、揄滤后，用热蒸馆水洗室元氯离子，在120C烘干备用。3.14 辈辈呈交G:薄层层析F碍。3.15 脱氧雪腐镰刀茵烯醇(以下简称DON)标准溶液，精密称职，5.0mg DON，加乙酸乙路-甲醇(19+1)贯穿解。转入10mL号尊重量瓶中，用乙毒草乙重量岱甲醇09+1)稀辈辈1臣费j度，比标准溶液食以剂。.5mg!mL。吸取此标准溶液。.5mL.用乙酸乙隙-Ifl醇(19十1)稀释至10mL.此
5、溶液每毫升含DON25g。4 仪镶4.1 小型粉碎税。4.2 电动振荡器。4.3 75 mL玻漠然发题。53 GB/T 5009.111-2003 4.4 层析校z内径2cm，长10cm，不具活塞。4.5 10 mL具塞浓缩瓶g底部具0.2mL刻度尾管。4.6 玻璃板，5cmX20 cm. 4.7 薄层涂布器，0.3mm。4.8 展开槽z内长25cm，宽6cm，高4cm. 4.9 紫外光灯，365nm。4.10 微量注射器，10L.50L。4.11 50 mL平底管。4.12 双波长薄层扫描仪z带数据处理机。5 分析步骤5.1 提取称取20g粉碎试样置于200mL具塞锥瓶中，加8mL水和100
6、mL三氯甲炕无水乙醇(8十2)，密塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，振荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置90C水浴上通风挥干，5.2 净化5.2.1 液-液分配5.2. 1. 1 谷物z用50mL石油隧分次溶解蒸发皿中的残渣，洗人100mL分液漏斗中，再用20mL(玉米试样用30mL)甲醇水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。5.2. 1. 2 谷物制品(蛋糕、饼干、面包等)，用100mL石油隧分次溶解蒸发皿中的残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用30mL甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转人同一分液漏斗中。振摇分液漏斗1.5min，静置约15mi
7、n使分层后，将下层甲醇-水提取液过柱净化，不要将两相交界处的臼色絮状物放入柱内。5.2.2 柱净化5.2.2.1 小麦及其制品s在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每15s 18漓20滴(3mL/min)，甲醇水提取液过柱快完毕时，加入10mL甲醇-水(4+1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在2 mL/min3
8、mL/min，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。5.2.2.2 玉米2同5.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3g。5.3 制备薄层层析用样液将过柱后的洗脱液倒入75mL玻璃蒸发皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干。5.3.1 小麦z趁热加人3mL乙酸乙醋，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的DON溶出，并将乙酸乙酶挥发至干，再加入3mL乙酸乙酶同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3mL乙酸乙酶，加热至沸，放冷至室温后转入浓缩瓶中，再用三份1.5 mL乙酸乙醋洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。5.3.2 小麦制品、玉米z趁热加入3mL乙酸
9、乙酶，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中DON溶出，放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约0.5mL甲醇-丙翻0+2)于蒸发皿中，用玻棒搅动溶解残渣，将蒸发皿置水浴锅上挥干溶剂后，加入3mL乙酸乙酶，加热至沸，转动蒸发皿，使充分沸腾，放冷至室温后转人罔浓缩瓶中，再用0.5mL甲醇丙翩。+2)和3mL乙酸乙醋同样处理一次，乙酸乙醋提取液并人浓缩瓶中。54 GB/邱吉9.111-2003将浓缩瓶里量约95C水浴锅上，用蒸汽加热吹氯气浓缩蛮干，放冷至草草温后加入0.2mL三氯甲烧乙擒(4+1)理事解残渣留作善事层层析筋。5.4 iJ睡定5.4.1 薄层板的制备:4日硅胶G加约
10、9mL 15%氯化铝(AIC1，.6H，Q)水溶液，研磨约2min :?呈粘稠状，铺成5cmX20 cm的薄层板三块，宣室温干燥后，于105C活化1h，贮干燥器中备用.5.4.2 点辛辛z在每块薄层板上距下端2.5c臣的毒牵线上点祥。第一块板g对每一个试祥先点第块薄层板。在距板左边缘1.8 cm处点25L样液，在距板上端1. 5 cm坠的横线上并与基线试祥点相对应的位置上点2LDON标准液(50ng)曰按5.4.3.1条下横震薄层板，事辈子溶剂后再往薄层板上盖在左边缘1cm处前基线上点2严LDON标准液(50ng). 第二块版s在第一块板上未显荧光的试祥则需在第二块溥层板上/!左边缘。.8cm
11、lcm处滴加25L样液，加1L标准液(25ng)，在距左边缘2cm处滴加1L标准液(25ng).在距右边缘1.2 cm 处漓泌2L标准液。对i驳校试祥则进行模路定蠢z在薄层板上/!左边缘。.8cm-1 cm处滴虫B样液点(根据情况估汁滴加量，或稀辑后定量)，在距板左边缘2cm处和在距右边缘1.2 cm处分别满加二个标准点，DON的簸可为50n缸.75ng、100ng。再在距板上端1.5 cm处的横线上点三个DON标准点(各约50ng)，使之与基线上的三个点相对应e5.4.3 展开横展剂z乙隧、乙隧冈酣(95十日或无水乙醋。任选其中一种，使试样DON点偏离原点。.7 cm 1 cm，lI好与杂质
12、荧光分卉。纵展)!IJ:芝，氯平统-窝藏-异离董事(8十1十1)多二王氯甲烧丙酬创异丙醇水(7.5+1十1.5+0.1)。5.4.3.1 横展:在展开槽内倒入10mL横展剂。将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端过1mn2白白，取出遂成挥于3mn对小麦赵品还主要再混10mL石油重建(30C60C)横晨一次，展至板端过1min，取出通风挥千5mino 5.4.3.2 纵展s在展开槽内倒入10mL纵展剂。将横展挥千后的薄层板宣展开槽内纵展15cm，取出通JXl.葬于10阻in，由于DON与杂质分离的效果受空气湿度影碗较大，当板部分离效果不太好时ap第一块湾层板的试样点附近有杂质荧光干扰
13、时，可按极性大小依次换用以下几种展开方式ga) 三氯fjl统一丙翻白异醇(8十1+1)。bJ 三氯钢烧-丙颠-j事芮醇(8+1十1)并在展开槽盖内部贴上水饱和的滤纸。c) 三氯Ifl土完丙哥哥异肉醇水(7.5十1十1.5十0.1)。d) 三氯阳炕丙酬异丙醇水(7.5+1十1.5中0.1)并在展开糟内阁贴上水饱和的滤纸。改换纵展方式，展开第二块薄层板。如展开糟内极性太太.会使DON点变偏g5.4.4 显荧光z先观察未加热始薄层板可见到主主蓝紫荧光的干扰点，这岭DN不主主荧光，加热簿层板后，杂质点仍戴荧光，它在DON荧光点附近，但不干扰DON，然后将此薄层板毁130C烘箱中加热7 min ,-._
14、, lO min，取出放在冷的表面上1min-5 mn后于365nm紫外光灯下观察。5.4.5 观察与评定z薄层板经横震后，板上撑液点的DN移动约0.7cm- cm.是根据这一点在纵展后使试样DON点摆脱了杂质荧光的干扰。薄f器板上端未经纵展的二三个DON标准点可分别作为横展后试样DON点和二个你准DON点的横向定佼点，试样。ON点又可与纵展后的DON标准点比较Rd题哥哥定性，这样从横向和纵向两个方画确定试祥DON点约位置，达到定性始自悦。三个标准DON点的位置上均觉杂质荧光干扰。如在第一块薄层板上样液未显荧光，而在第二块薄层板上25L梯液+25ng标准所显荧光强度与25ng标准DON相等，则
15、试祥中DON含量为阴性或0.05mg/kg以下。阳性试中丰概赂定量时，虽然薄nt板上三个DON点在横庭中都丰富有移动，但对各点荧光强度无影碗，费每个标准点均可建子辛苦试祥DON点比较荧光强度。55 GB/T 5009.111-2003 5.4.6 薄层光密度计测定:激发光波长340nm、发射光波长400nm。在薄层板上标准DON荧光点至少在100ng、200ng、400ng时，测得的响应与DON的量才呈线性关系。对DON含量在0.3mg/kg以上的试样才用光密度计测定。当DON含量在O.3 mg/同时点20L样液使测得的DON量落在100 ng200 ng之间。用薄层光密度计测定时每块板上滴加
16、二个标准DON点，DON标准点的量为100吨，200ng或200晤，400吨，以测得的峰面积值为纵坐标，DON的量为横坐标，绘制标准曲线。5.4.7 结果计算按式(1)计算:1一 D v卫队J A X . ( 1 ) 式中zX一一试样中DON的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); A 薄层板上测得样液点上DON的量，单位为微克(g); V1-加人三氯甲炕乙脯混合液溶解残渣的体积，单位为毫升(mL);V2-一-滴加样液的体积，单位为毫升(mL);D 样液的总稀释倍数gm 兰氯甲烧-乙腊混合液溶解残渣相当试样的质量，单位为克(g)。5.4.8 精密度:当空白小麦中加入DON量为0.3、0.5、1
17、mg/峙，每个水平n4时，目视比较测定结果分别为0.237g士0.025g ,O. 5 g土0.081g、0.097g土0.112g，用薄层光密度计测定结果分别为0.290g 土0.053g、0.456g士0.077g , l g土0.15g(小麦制品的DON回收率为80%100%)。空白玉米中加入DON量为0.3、0.5、1mg/kg，每个水平n4时，目视比较测定结果为0.234g士0.05g，0.415土0、0.800士0。以上数据为X士SDo第二法免疫测定法(ELISA)6 原理将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待检试样(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，
18、在国相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗免疫球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物结合，加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，根据标准曲线计算被测试样中的抗原量。7 试剂7.1 抗体g杂交瘤细胞系3D7产生的抗呕吐毒索的特异性单克隆抗体。7.2 抗原z呕吐毒素与载体蛋白-牛血清白蛋臼(BSA)的结合物DON-BSA)。7.3 牛血清白蛋白(BSA)，四甲基联苯胶，兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物。7.4 吐温20，30%过氧化氢(H202).甲醇，三氯甲烧，石油酶，无水乙醇，乙酸乙
19、酶，中性氧化铝和活性炭。所有其他化学药品，均为分析纯试剂，水为蒸馆水或同等纯度的水。7.5 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，配制方法为称取1.59 g碳酸纳(Na2C03).2.93 g碳酸氢销(NaHC03)加水稀释至1000mL 7.6 洗涤液为含0.05%吐温20的pH7.4的碳酸盐缓冲液(简称PB5-T)。配制方法为:56 GB!T 5009.111-2003 称取磷酸二氮仰(KH，PO，)0.2g.磷酸氮二纳(Na，日PO， 12日，0)2.9日，氯化销(NaCD8.0g.氯化饵(KCl)0.2g.破浪-200.5 mL.加水至1000mL。7.7 底物缓冲液为pH5.。她磷酸
20、拧稼酸缓冲浪，重E划方法为，0.1mol!L拧镀酸(C，H，O，.H，O).黯称骂主拧橡酸21.0 g.:1lll水至1000mL为限液事0.2 mol/L磷酸氢二锅(Na，HPO，)，郎称取磷酸氢二锵28.4日，加水至1000mL.为乙液g取甲液24.3 mL.乙液25.7mL.加水至100mL.即可。7.8 呕吐毒素标准溶液用甲醇配成1mg/mL呕吐毒素贮备液，一20C冰箱贮存。子检测当天，精密吸取贮备液，用20%Efl董事部PBS(恶毒4方法闵PBS-T.不如贯主戴晴勿在草可)稀释成制备标准磁线的所需浓度.S 仪器所用玻璃器肌均用硫酸洗液浸泡，用商来水洗，蒸馆水冲洗。8.1 酶标检测仪s
21、8.2 酶标微孔板(40于L或96孔); 8.3 电动振荡器p8.4 电热恒温水浴锅s8.5 具0.2mL尾智的10mL小浓缩瓶$8.6 250 mL分液漏斗。9 分析步骤9.1 提取称20g粉碎并递过20吕燎的试祷，最2四L吴塞三角烧瓶中指主n8四L水和100黯L三氯卒读完水乙喜事(4十口，在瓶里事上抹一层水盖严防漏.振荡1h后，通过快速定性滤纸过滤，取25mL滤液子蒸发皿中，置90C水肖穿上通风挥干。用50mL石油隧分次溶解蒸发皿中残渣，倒入250mL分液漏斗中，再用20mL申辩w水(4+1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，搬苦奋1.5 min，收下层甲醇e水提取液过层析柱净化层析校的装备z
22、在层析柱下端子小管相连接处寨人约0.1g脱脂棉，尽最寒紧，先装入0.5 g中注氧化银，敲平表窟，再加入0.4g活性炭，敲紧)。将过柱后的2辈辈是液倒入蒸发豆豆中，将蒸发直在童子水浴锅上浓缩3王子，趁热恕3mL乙毅乙簸，却热至挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙戳，冷至室温后转入主主愿智的10mL浓缩瓶中。ffl适量乙酸乙酶洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95C水浴锅上用蒸汽加热，挥干，冷却后用0.2mL含20%甲醇的PBS容，供ELISA检测用。9.2 ELlSA检测9.2.1 用DON-BSA(20路ImL)包被梅栋微孔板，每孔100L.4C过夜。队2.2董事标板F在PB5-T苦是3次，
23、每次3mn后，级人不同浓度灼DON标准溶液哥哥作标准战线或试样提取液检测试幸革命的毒素含量与抗体溶液的混合液。十门，每孔1L.该混合液l2l于使用的前一天配好.4C过夜，备用，置37C1 h。9.2.3 酶标板洗3次，每次3mn后，加入酶标二抗，每孔100L.37C1. 5 h , 9.2.4 同上述洗涤后，加入酶底物溶液PJ我5LTMB(lO mg TMB溶于1mL二甲基甲酷胶中)溶液加10田L底物缓冲液加10严L30%过筑化氧，混匀.每孔100L.37C30 mn. 9.2.5 周2mol/L就酸溶液终止反应，每孔50L.于45古nm处泌定吸光度筐。57 GB/T 5009.111-2003 10 结果计算按式(2)计算gX=cX旦XX.lV2 m 式中zX 呕吐毒素浓度，单位为纳克每克(ng/g); c 酶标微孔板上所测得的呕吐毒素的含量(根据标准曲线求得)，单位为纳克(ng), V , 试样提取液的体积，单位为毫升(mL)，V2一加入样液的体积，单位为毫升(mL)，D一一样液的总稀释倍数Pm 试样质量，单位为克(g)。11 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。58 ( 2 )
