1、ICS 67040C 53 囝亘中华人民共和国国家标准GBT 500911 82008代替GBT 5009118 200320081 1-21发布谷物中T一2毒素的测定Determination of T-2 toxin in cereals2009-0301实施中华人民共和国卫生部套士中国国家标准化管理委员会友仲月IJ 舌GBT 50091 1 82008本标准代替GBfI5009118 2003(小麦中T一2毒素的酶联免疫吸附测定(El，ISA)。本标准与GBF 5009 11 8 2003相比主要修改如下：修改了标准的中文名称，标准的中文名称改为“谷物中T一2毒素的测定”；增加了高效液相
2、色谱法作为第一法。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国1生部负责解释。本标准负责起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位：北京中检维康技术有限公司。本标准主要起草人：隋凯、李军、卫锋、肖珊珊、杨春光、戚应春、阳传和、罗雪云、计融。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 14933 1 994、GI-IT 5009118 2003。谷物中T一2毒素的测定GBT 50091 1 820081范围本标准规定了谷物中1_2毒素的测定方法。本标准适用于谷物及其制品中T一2毒素的测定。本标准的第一法检出限为10
3、ttgkg，第二法和第三法的检出限为1 pgkg。第一法 高效液相色谱测定法2原理试样中的T 2毒素用甲醇水提取后，提取液经免疫亲和柱净化，浓缩、衍生、定容后，用配有荧光检测器的液相色谱仪进行测定，外标法定量。3试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相当纯度的去离子水。31 甲醇(LH。OH)：HPI。C级。3 2乙腈(CH。CN)：HPI。C级。33甲苯(C。HjCH。)：HPIC级。34甲醇水(8+2)：取80 mL甲醇，加20 mI。水。35 4一二甲基氨基吡啶(DMAP)溶液：准确称取0032 5 g于100 mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。36卜氰酸蒽(1-anth
4、roylnltrile，1-AN)溶液：准确称取0030 0 g于100 mI。容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。37 T 2毒素(T一2 toxin)标准品：纯度98。38 T 2毒素标准溶液：准确称取适量的T 2毒素标准品，用乙腈配成浓度为05 mgmI。的标准储备液，一20冰箱中避光保存。使用前用乙腈稀释成适当浓度的标准工作液。39 T 2毒素免疫亲和柱。310玻璃纤维滤纸。4仪器和设备41液相色谱仪配有荧光检测器。42粉碎机。43高速均质器。44氮吹仪。45离心机。46涡旋混合仪。47空气压力泵。48玻璃注射器：20 ml。49天平：感量0000 1 g。1GBT 50091 1 82008
5、5分析步骤51提取称取试样50 g(精确到001 g)于500 mL玻璃混合杯中，加入100 mI。甲醇一水(8+2)，高速均质2 rain后，3 000 rrain离心5 min，上清液经定量滤纸过滤，移取100 mI，滤液并加入400 ml。水稀释混匀，以玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清后，进行免疫亲和柱净化操作。52净化将免疫亲和柱连接于20 mI。玻璃注射器下。准确移取100 mL(相当于10 g样品”)的51提取滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以1 mLmin流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体。以10 mI。水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并
6、使部分空气通过柱体。加入15 mL甲醇(31)洗脱，流速为1 mLmin，收集洗脱液于玻璃试管中，50以下氮气吹干，待衍生。53衍生于52净化后的样品中，分别加入50“I。4二甲基氨基吡啶(DMAP)溶液和50 t*I。1一氰酸蒽(1-AN)溶液，涡旋混合1 rllin，于502恒温水浴中反应1 5 rain，在冰水中冷却10 min。50以下氮气吹干后。用10 mL的流动相541b)溶解，供液相色谱测定。54测定541液相色谱条件a)色谱柱：c，8柱，461 50 ram(内径)，粒度5 pm，或相当者：b) 流动相：乙腈一水(80+20)；c)流速：10 mLmin；d)检测波长：激发波长
7、381 nm，发射波长470 nm；e)进样量：20 p1；f)柱温：室温。542色谱测定根据样液中T一2毒素衍生物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中T一2毒素衍生物响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下，T一2毒素衍生物的保留时间约为98 min。T一2毒素衍生物的标准色谱图见图1。T 2毒素衍生物l 且图1 I-2毒素衍生物的标准色谱图1)对于玉米赤霉烯酮含量较高的样品，可将提取滤液进行适当稀释，以保证玉米赤霉烯酢j的含量不超过免疫亲和柱的最大毒素负荷量。u黔埒mo0GBT 5009 1 18200855空白试验
8、除不加试样外，均按二述步骤进行。56结果计算用外标法按式(1)计算试样中T 2毒素衍生物的含量，计算结果需将空白值扣除 000(A A)VA一T丽矿if叉i一式中：x 试样中rI 2毒素衍生物的含量，单位为微克每千克(pgkg)；A 样液中T-2毒素衍生物的峰面积；A 空白样液中T 2毒素衍生物的峰面积；c 标准工作溶液中rI2毒素衍生物的浓度，单位为微克每毫升(ffgmI。)V 样液最终定容体积，单位为毫升(mI，)；A。 标准工作溶液中T 2毒素衍生物的峰面积；m 最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 5。第二
9、法间接法7原理将已知抗原吸附在同相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测试样(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后在同相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原一抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。8试剂81 甲醇。82石油醚。83三氯甲烷。84无水乙醇。8 5乙酸乙酯。8 6二甲基甲酰胺。87四甲蕈联苯胺(TMB)。88吐温20。89 30过氧化氢(30H：O。)。810抗体：杂交瘤细胞系1D7产乍的抗T
10、 2毒素的特异性单克隆抗体。8” 抗原：T 2毒素与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)的结合物。812兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。813 ELISA缓冲液系统。8131 包被缓冲液为pH96的碳酸盐缓冲液，称取159 g碳酸钠(Na!CO。)、293 g碳酸氢钠(NaHc03)，加水稀释至1 000 mL。8132洗液为含005吐温一20的pH74的磷酸盐缓冲液(简称为PBST)。配制方法为：GBT 500911 82008称取02 g磷酸二氢钾(KH 2PO。)、29 g磷酸氢二钠(Na：HPO。1 2II：()、80 g氯化钠(NaCI)、02 g氯化钾(KCI)、05
11、 m1吐温一20，加水至1 000 mI。8133底物缓冲液为pH50的磷酸一柠檬酸缓冲液，配制方法为：01 molI，柠檬酸(c。H。【J。H!(j)，即称取柠檬酸1 92 g，加水至l 000 mI为甲液；02 moI。磷酸氢二钠(Na：HPO。)，即称取磷酸氢二钠717 g，加水至1 000 IIlI。，为乙液；取甲液243 m1，乙液257 mI。，加水至100 mI，即可。81 34底物溶液：取50ftI。TMB(10 nag TMB溶于1 ml。二甲基甲酰胺中)溶液十lo mI。底物缓冲液一10 pI，30过氧化氢，混匀。814 T 2毒素标准溶液：用甲醇配成l mgmI。T 2毒
12、素贮备液，一20冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20甲醇的PBS(配制方法同PBS T，不加吐温一20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。9仪器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。91酶标检测仪。92酶标板(40孔或96L)。93电动振荡器。94电热恒温水浴锅。95具02 ml。尾管的10 mI，小浓缩瓶。10分析步骤101提取称取20 g粉碎并通过20目筛的试样，置200 mL具塞锥形烧瓶中，加8 ml，水和100 mI。三氯甲烷无水乙醇(4+1)，密塞，振荡】h，通过滤纸过滤，取25 mI滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50 mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，
13、洗人250 mL分液漏斗中，再用20 mI。甲醇水(4+1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇15 min，静置约1 5 min，收下层甲醇水提取液过层析柱净化(层析柱的装备；在层析柱下端94,管相连结处塞约01 g脱脂棉，尽量塞紧，先装入05 g中性氧化铝敲平表面，再加入04 g活性碳，敲紧)。将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至于，趁热加3 mI乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3 mI。乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并人浓缩瓶中，将浓缩瓶置95水浴锅上，挥干冷却后，用含20甲醇的PBS定容，供El。ISA检测之用。102 ELISA检测
14、1021 用T 2 BSA(4*gmI)包被酶标板每L l。0 pI。，4过夜。1022酶标板用PBS 1洗3次，每次3 rain后，加入不同浓度的T 2标准溶液(制作标准曲线)或试样提取液(检测试样中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1+1，每孔100 pI。，该混合液应于使用的前一天配好，4过夜备用)，置371 h。10 23酶标板洗3次，每次3 rllin后，加入酶标二抗，每孔100 pL，3715 h。1024同上述洗涤后加入底物溶液，每孔lOo pI。，3730 min。1025用1 molI，硫酸溶液终止反应，每孔jo pI。，于450 nill处测定吸光度值。11结果计算按式(2)
15、计算一x瓷D去式中：r一r一2浓度，单位为纳克每兜(ngg)；GBT 5009 1 1 82008岫 一酶标板上所测得的T一2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克(rag)； 斌样提取液的体积。单位为毫升mI，)；V!一滴加样液的体积，单位为毫升(rn。)；D一样液的总稀释倍数；171 试样质量，单位为克(g)。12精密度在莛复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20。第三法直接法13原理将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与试样(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原一抗体一酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物
16、。在酶的催化作用下+底物发生降解反应，产牛有色物质，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。14试剂141 甲醇。142石油醚。143三氯甲烷。144无水乙醇。145乙酸乙酯。146二甲基甲酰胺。147四甲基联苯胺(7FMB)。148吐温20。149 30过氧化氢(30H!O!)。1410抗T一2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。141t抗原：T 2毒素与载体蚩白牛血清白蛋白的结合物(T 2一BSA)。1412 EI。1SA缓冲液系统。1412 1包被缓冲液为ptt96的碳酸盐缓冲液，称取159 g碳酸钠(Na zCOj)、293 g碳酸氢钠(NaHCO。)，加水稀释
17、至l 000 mI。14122洗液为含005叶温20的pH 74的磷酸盐缓冲液(简称为PBS T)，配制方法为：称取02 g磷酸二氯钾(KHPO。)、2 9 g磷酸氢二钠(Na：HPO。1 2H：o)、80 g氯化钠(NaCI)、02 g氯化钾(KCI)、05 mI。叶温一20，加水至l 000 m1。15仪器所有瑗璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。151酶标检测仪。152酶标板(40孔或96孔)。5GBT 500911 82008153电动振摇器。154电热恒温水浴锅。155具02 mI。尾管的10 mI。小浓缩瓶。16分析步骤161提取称取20 g粉碎并通过20目筛的试样，置2
18、00 mI。具塞锥形烧瓶中，加8 mI，水和1 00 ml。王氯甲烷无水乙醇(4+1)，密塞，振荡1 h，通过滤纸过滤，取25 mI。滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50 mI，石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250 ml，分液漏斗中，再用20 mI。甲醇水(41)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇15 rain，静置约1 5 mtn，收下层甲醇水提取液过层析柱净化(层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约01 g脱脂棉尽量塞紧，先装入05 g中性氰化铝敲平表面，再加入04 g活性碳，敲紧)。将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿巾，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3 mI。乙酸乙酯，加热至沸挥于
19、，再重复一次，最后加3 ml，乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上，挥于冷却后，用含20甲醇的PgS定容，供E1，ISA检测之j订。162 ELlSA检测1621用T 2 BSA(4 btgmL)包被酶标板，每7L 100“L，4过夜。1622酶标板用PBST洗3次，每次3 rain后，加入不同浓度的T 2标准溶液(制作标准曲线)或试样提取液(检测试样毒素含量)与抗体酶结合物溶液(1+100)的混合液(1+1每孔100 ftL，该混合液应于使用的前一天配好，4过夜备用)，置3715 h。1623酶标板洗3次，每次3 min后，加入底物溶液。每孔1 00“I，3730 rain。1624用1 molL硫酸溶液终止反应，每孔50 pI。，于450 nm处测定吸光度值。17结果计算按式(3)计算D土 (3)优式中：rT一2浓度，单位为纳克每克(ngg)；m，酶标板E所测得的T 2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克(ng)v。一 试样提取液的体积，单位为毫升(mI。)；K一-_滴加样液的体积，单位为毫升(mL)；D样液的总稀释倍数；卅一试样质量，单位为克(g)。
