1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 5009.158-2003 蔬菜中维生素K1的测定Determination of vitamin K1 in vegetables 2003-08-11发布20饵的田的实施320 中华人民共和国卫生部发布中国国家标准化管理委员会G嚣.fT5串串立158-2003苟言本标准对1ilI于AOAC.45维生索和营养素部分食物中维生素D的测定(1995年英文版)，本标准与AOAC.45的一致性程度为非等效。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位$中雷预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标准主要起草人z王竹、王光亚、周瑜
2、华、王国栋、杨月欣。321 GB/T 5009.1582003 苦i言本标准参考AOAC.45缕线索和营养素部分食物中维生紫D始草草定0995年版的草草处理过程，以磷戳盐处理过的氧化铝为色谱枚，应用高效液秘色谱反相往对盖在菜中维生素犯进行定性及囊分析.322 GB/T 5009.158-2003 蔬菜申维生素凡的测定1 范围本标准规定了蔬菜中维生素凡的测定方法。本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素民的测定。本标准方法出限为0.5阅，线性范围为1g/mL-100g/mL.2 原理蔬菜中的维生素也经石油酷提取后，注入经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱中进行色谱分离，除去干扰物。收集含维生素凡的
3、淋洗液流分，浓缩定容后注入高效液相色谱柱，用紫外检测器，在248nm处测定.以外标法计算试样中维生素凡的含量。3 试剂和材料色谱用水和有机溶剂使用前均需重新蒸馆.3.1 元水硫酸销s使用前需在150C的烘箱内烘烤4h-8 h.以去除水分。3.2 O. 14 mol/L硫酸销溶液g称取20g元水硫酸锅，用蒸馆水溶解后定容至1L。3.3 丙翻。3.4 石油黯沸程30C-60C。3.5 乙隧g不含过氧化物。3.5.1 过氧化物的检查方法g用5mL乙隧加1mL O. 6mol/L腆化饵溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碟，水层呈黄色.或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该乙酶含有过氧化物需处
4、理后使用。3.5.2 去除过氧化物的方法z重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去首尾10%部分，收集馆出的乙黯。再检查过氧化物，应符合要求。3.6 洗脱液g石油隧+乙隧(97+3)。3.7 甲酶g优级纯。3.8 正己炕g优级纯.3.9 中性氧化铝z层析用.100目-200目。3.9.1 氧化铝的处理2取250g中性氧化铝.20g磷酸氢二锅.1.6 L水，放人容积为2L的锥形瓶中，置于沸水浴30min，不时摇动。冷却，倒掉上层液体(包括悬浮的细小颗粒).然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150C干燥箱中烘烤3h-5 h至两次称量相差3g以下.烘烤过程中不时搅拌，以避免结块，冷却后放人干燥器中
5、保存。3.9.2 失活z将磷酸盐处理的氧化铝(3.9.1).加入具塞锥形瓶中。按每100g氧化铝加9.0mL水的比例加入去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80C干燥箱加热3min.Smin，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30min，使水分分布均匀。3.9.3 氧化铝的检验s取标准使用液1.0 mL.用氮气(3.11)吹干，再用石油酷(3.4)溶解定容至1. 0 mL。然后按5.2.2.1装柱，将标准溶液加人柱上，按5.2.2.2色谱分离步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶(4.5.1)收集含有维生素凡的洗脱销分，浓缩，氮气吹干，用正己统(3.8)定容至1.0 mL。进样，HPLC测
6、定，记录峰面积或峰高(A另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高(A，)。将A与A，进行比较，其值在0.97-1.03之间(A/A，).说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处323 GB/T 5009. 158-2003 现。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需建新制备氧化铝。3.10 维生素K1(纯度98%)标准溶液。3.10.1 维生素Kl标准储备滚z准确称取50.0mg维生素也纯品，于50四L棕色容量瓶中，用正己统溶解并稀释定容至1越度，那储备液浓度为1.0mg!mLo将储备接分装成安瓢，冷冻保存e3.10.2 维生素几标准使用滚z准确吸取续生署哥儿标准储备液(3.10.
7、1)，用正己嫁接1 50比例准确稀释，即该维生素K1标准工作液浓度为20g/mL。3.10.3 标准使用液的标定2取维生素K1标准使用液，于波长248nm处，测定紫外吸光度假，比色杯朦朦1cm，以正己烧为室里白，测定3次，取平均由草，接式(1)计算标准工作液浓度。X且会Xm X 10 主主中2x-一-维生素几标准使用液浓度，单位为徽克每毫升严g!西L)多A一一标准使用液平均紫外吸光度值$E一一摩尔消光系数20000; m一一-维生素K1分子最450.7;10一一出克每升(g!L)换算成微克每毫升仰自ImL)的换算系数。3.11 高纯氮气99.9%。4 仪镰与设备4.1 实验室常用设备。4.2
8、打碎机。4.3 恒温干燥箱。.( 1 ) 4.4 色谱拄z为0.8cmX30 cm的菠漓柱。底端收缩变绩，装有活惑，活3摆上约1cm处有一玻璃筛板，筛板子L径为16m30扭。校上端澎文为容积约30四L部储液池。使用前需干燥。4.5 旋转蒸发器。与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶z具塞，因底，容积为150mLo 4.6 恒温水浴锅。4.7 高速离心机。与高速离心机配套的小离心管z具塞，容积为1.5 mL3. 0 mL。4.8 紫外分光光J3(汁。4.9 离效液幸自色谱仪，带紫外检泌器。5 分析步骤(所有操作均稽避先进行5.1 试样处理5.1.1 新鲜试样去除杂物，将可食部洗净，擦去表面水分，切碎，用打
9、碎机制备成匀浆。避光低温保存。5. 1. 2 干吉普试样z磨碎，这60吕簸，混匀，遂光低温保存也5梅2试样预处理5.2.1 提取5.2.1.1 新鲜试样z准确称取2.000 g 10.000日(维生素K1含量不低于2g)，加至具塞俄形瓶中，加入510倍体积的丙酬(3.3)，盖上塞子，振摇3min_S min.，静置1minQ以下按5.2. 1. 3操作。5.2. 1. 2 于和l试拌2称耳边O.200 g4. 000以维线索K1含量不低于2g)，加到研钵中，再加入24倍蠢的无水硫重量镜研磨均匀后，转入锥形瓶，加入25mL PS癫，振摇3min-S min，静置1西n。324 GB/T 5009
10、. 158-2003 5.2. 1. 3 将上清液转移至盛有50mL O. 14 mol/L硫酸销溶液的分液漏斗中，用25mL丙酬分2次3次洗涤残渣，上清液并人分液漏斗。继续用25mL石油酶(3.4)洗涤锥形瓶3次4次，至无色为止，并人同一分液漏斗中.振摇1mn，静置分层。弃下层水相，反复用0.14mol/L硫酸锅溶液洗涤有机相，至水相澄清为止。将有机相通过盛有无水硫酸铺的漏斗，滤至旋转蒸发瓶中，用石油隧洗涤分液漏斗和无水硫酸锅层，洗涤液并人旋转蒸发瓶。5.2. 1. 4 浓缩与定容z将上述提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度80C，蒸发至约1mL，取下旋转蒸发瓶用氮气吹于，加入2.0mL石
11、油隧溶解并定容。备柱色谱用。5.2.2 柱色谱5.2.2.1 装柱=取干燥色谱柱，将验证好的氧化铝浸泡于石油隧中，湿法填充色谱柱，使氧化铝自由均匀流下，至柱高为20cm，其上端再加1cm元水硫酸销。打开活塞，调整流速为每秒1滴.5.2.2.2 色谱分离g待石油酶流至柱上端。.5cm时，加1mL试样提取液，待提取液流至与柱上端平齐时，加2mL石油隧冲洗柱壁。再加10mL石油酶2次，洗涤，弃除流出液。然后，用30mL洗脱液洗脱，用旋转蒸发瓶收集流出液。5.2.2.3 浓缩定容g将上述流出液于旋转蒸发器浓缩至近干，取下用氮气吹干后，用正己统定容为2 mL。5.3 测定将定容液移人小塑料离心管中，离心
12、5min(5 000 r/min)，上清液供HPLC分析。5.3.1 商效液相色谱分析条件(参考条件)预柱ultrasphere ODS，粒度10m，规格4.0mmX45 mmo 分析柱ultrasphere ODS，粒度5m，规格4.6mmX250 mm。流动相甲碎+正己烧(98+2)。流速1.5 mL/mino 进样量20L。检测器紫外检测器，波长248nm，量程O.010. 05。5.3.2 定量测定5.3.2.1 仪器稳定性测定z按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度(AUFS)，为准确测定，按要求对分析柱进行系统适应性实验。取标准使用液按分析条件进样测定，连续6次，计算峰面积
13、或峰高的平均值、标准差和相对标准差(RSm，如果RSDl%，说明仪器稳定性良好，可进行试样测定。5.3.2.2 标准曲线g分别取维生素K，标准使用液0.50，1.00 , 2. 00 , 4. 00 , 6. 00 ,8. 00 , 10. 00 mL，加入分液漏斗中，按试样提取和柱色谱步骤处理，最后浓缩定容至1.0 mL，即标准工作曲线中各点维生素K，含量分别相当于5.0，10.0，20.0，40，0，60.0，80.0，100.0问/mLo按5.3.1分析条件进行测定，记录峰面积或峰高.以维生素K，含量为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线。5.3.2.3 试样测定g取试样浓缩液(5.
14、2.2.3)，按5.3.1分析条件进样测定。6 结果计算试样中维生素凡的含量按式(2)计算。式中zx = cXV:.XV3 X 100 一V2 Xm X一一试样中维生素凡的含量，单位为微克每百克(g/100g); c 由标准曲线上查出或回归方程求出的维生素K，结果，单位为微克每毫升(g/mL);V , 试样提取后定容体积，单位为毫升(mL)，.( 2 ) 325 GB/T 5009. 1582003 V，一一试稼校色潜龄的滚滚量，单位为毫升(mL);V，一一试稼校色港分离后她定容体积，单位为毫升(mL);由一一试幸事mt囊，单位为克(g)。计算续采保留三位有效数字.7 精密度在重复悦条件下获得的两次独立测定结果的绝对慈债不得超过算术平均值的10%。326
