1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准2003-08-11发布GB/T 5009.189-2003 部分代替GB11675-1989 银耳中米酵菌酸的测定Determination of bongkrekic acid in tremelJa fuciformis berk 2004-01-01实施500 中华人民共和国卫生费发布中国服家标准住管理委员去GB/T 5009. 189-2003 前言本标准代替GB11675-1989银耳卫生标准中5.1米酵菌酸的测定。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由河南省食品卫生监督检验所、河南省南阳地区卫生防疫站负责起草。本标准
2、主要起草人g任中善、马军、赵国庆、张丁、韦喜亭。501 GB/T 5009. 189-2003 引言米酵菌酸bongkrekicacid (BA) .即酵米面黄杆菌毒素A(flavotoxin A) 是由椰毒假单胞菌(pseudomanas cocovenenans)产生的一种可以引起食物中毒的毒素。系统命名为:3竣甲基17甲氧基6.18.21-三甲基甘二碳2.4.8.12.14.18.20七烯二酸。502 GB/T 5009. 1892003 银耳中米酵菌酷的测定1 1ci:回本标准规定了银耳中米酵菌酸的测定方法。本标准适用于银耳中米辫噩酸灼测定。薄层色谱测定法2原理试祥中的米酵磁酸经击是欲
3、、净化及浓缩后，根据其在短波紫外光GF.硅痰薄层色谱上显示黑色点的最低检出缝测定含量a3 仪器3.1 层析穰内径长X宽寓，25cmX6 cmX4 cm)。3.2 GF25磁胶薄恳切mmX200mmXO. 3 mm).自制，绞1l0C-1l5活化2h-3 h.登干燥器中可保存一题。3.3 紫外线灯(波长254nm)。3.4 紫外分光光度计。4 试剂本标准所用的试消除特殊规定外，均为分析纯，水为蒸馆水或肉等纬度的水，溶液为水溶液84.1 硅胶，GF阳层析用。4.2 薄层色谱展开ll!l，石浓重盖一无水乙酶-冰乙酸6合十份十1.5J。4.3 米酵商酸标准溶液z称取米酵随酸标准品，用阳醇配制成每毫升含
4、有米酵菌酸20g供测定用，置于4C冰箱中避光保存e4.4 甲醇。4.5 冰乙酸。4.6 石油酶，沸程30C-60C。4.7 元水乙重量。4.8 三氯fjI烧。4.9 85 g/100 mL磷酸霄4.10 40 g/L碳酸氮销水溶液e4.11 6 mol/L盐酸。5 分析步骤5.1 米霹黯戴的提浓子银耳试样经粉碎过40日筛后，称取20g，置具塞锥形瓶中，加人甲回事20mL，于窒浪中避光浸泡1 h.然后再加入三氯平统80mL军n85 g/100 mL磷酸口.2四L，辈革银耳试样经剪碎、磨缀及混匀后称取10日，加人甲醇16mL于室温中避光浸泡1h，然后再加人三氯甲烧64mL和85g/100 mL的磷
5、酸0.16 mL，振荡30mn，过滤，子银幕取滤液50mL，鲜银耳驭滤液40mL。503 GBI宜500.189-2003将以k滤液移人分液漏斗中，加入与滤液体积相同的破酸氢销水溶液，振摇2min，静置分层，用带自动控制球吸管吸出上层于另一分液漏斗中，再用碳酸氨销水溶液重复提取两次，每次10mL，轻摇，静置，将三次碳酸氧锵水层合并，加入二三氯甲烧25mL，振擦2min，静量分层后弃去三氯甲烧层，于分液漏斗中慢慢满人6mol/L盐重量以满该溶液p泣至23，加入革t岳重建沸程30C-60C)50mL(鲜银耳试样主U40黯Ll，辈革摇3mn，静量分层，取出石油磁层子梨形瓶中，手尊重复用石油重量约mL
6、和20mL各捷戴一次(鲜银卫平试样两次均为20mL)，将石油画盖层并入同一瓶中，于40C水浴中减底吹气浓缩至于，用Ifl醉移至带1mL刻度的浓缩管中，于40C用减压法浓缩空0.2mL以下，并用少许甲蹲洗管壁，继续浓缩至于.加fj1廓。.125mL，将干物质溶解，混匀，作为样液以供薄层色谱测定用a5.2 薄层包谶测定以薄E墨板的短边为底边，距底边3cm的基线上m徽蜜泼射器演加20严g/mL标准液SL与10L两个点，以及将液两个点，每点10L(鲜银耳试样满级20初，在样液跑一个点仨乎等漓郊20吨/mL标准液10Lo用展开弗j展开16cm，取出挥干。在254nm紫外灯光下观察结果如下ga) 标准点应
7、出现黑色点;b) 盘时学液点在标准点相应位庭上未出现黑色点，则成样中米酵菌酸的食慧在测定方法灵敏度0.25问/g以下d口在相应位置上有黑色点，而另点中样液与标准液点黛叠，则为阳性.根据样液黑点的强度估计减少满加微升数，或经稀释后再漓人不同徽升数d革3茧祥液与标准色点的强度与罢王积一致为止。米董事窟酸的比移值为0.22.5.3 结巢计算见式(1).式中gx = O. 2 X X D X .l ., 1 X一一米哥靠窗酸含量，单位为微克每克(Ig/g); 0.2一一米辈辈离酸的最低检出囊，单佼为徽克严g), V，一一加入甲醇溶解的体积，单位为毫升(mL)，V，一一出现最低检出量时滴加样液的体积，单
8、位为毫升(mL)，D 样液的总稀释倍数pm一-fj1醇溶解时相当试样的质蠢，单位为克(g).5.4 确证试验.( 1 ) 对含量董漓的试样可以进一步作确证试验;将剩余的招俊样液与空白fj1董事液分别经薄层分离后，部下并收集与米喜事黯酸标准相应的色潜丰曾与空白处硅胶。各加fj111事4mL.于室温中浸泡1h2 h，混匀，离心，吸出上清液，以空白硅胶甲喜事洗脱液作对照，用紫外分光光度计测定，应在267nm和236nm处有米酵菌酸的两个最高吸收峰。高压液梧色i普测定法5 原理试样中的米酵葛酸经提取、净化及浓缩后，根据在高压液相色谱上的出蜂ili积测定含量。7 试剂7.1 高压液相色谱洗脱弗G:甲醇也
9、水伺冰乙酸75十27十1.7J.在配制前，所用试剂及水均需分别重蒸憾。7.2其他试弗IJF号4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.吉、4.10、4.11。504 B 仪器8.1 高压液相色谱仪。8.2 20L试样环。8.3 紫外检测器，调波长至267nmo 8.4 积分仪。8.5 预柱4.6mm(!D)X5 cm，内装C8硅胶，粒度直径为10m。GB/T 5009. 189-2003 8.6 分析柱AltexUltrasphere TM-ODS，粒度直径为5m，4.6mm(ID)X25 cm o 9 分析步骤9.1 米酵菌酸的提取同5.1，但最后不用甲醇转移，直接于瓶内加入甲醇0
10、.5mL，将于物质溶解，混匀，取出上清液经离心后，置小试管中，作为样液供高压液相色谱测定用。9.2 高压液相色谱测定高压液相色谱操作条件z流速1.1 mL/min，纸速0.5cm/min，检定器灵敏度为将10g/mL标准液20L调至满刻度的70%90%。在做高压液相色谱时，首先用洗脱液平衡分析柱，从进样口装置分别进人不同浓度的标准液与样液各20L。在米酵菌酸标准峰面积的直线范围内，将样液与标准的峰面积相比以求出试样中米酵菌酸的含量。米酵菌酸的保留时间为17mino 9.3 结果计算见式(2)。式中:x cX丰XVXDXl.2z X 米酵菌酸的含量，单位为微克每克(g/g), c 米酵菌酸标准溶液的浓度，单位为微克每毫升(g/mL), A，一一样液的峰面积gA2十一米酵菌酸标准溶液的峰面积3V 加入甲醇溶解的体积，单位为毫升(mL)，D 样液的总稀释倍数gm 甲醇溶解时相当试祥的质量，单位为克(g)。9.4 确证如阳性试样还需用薄层色谱法中样液与标准液点重叠的方法确证。( 2 ) 505
