1、ICS 67040C 53 囝国中华人民共和国国家标准GBT 50092 1 0200820081121发布食品中泛酸的测定Determination of pantothenic acid in foods2009-03-0 1实施宰黼稿端鍪发布中国国家标准化管理委员会捉19刖 再本标准修改采用国际分析家学会(AOAC INTERNATI()NAI)中AOAC 945 74维生素预混料中泛酸的测定(Pantothenic acid in vitamin preparations)。本标准与A()AC 94574相比主要差异为：修改了试样提取步骤；增加了试样酶解处理：扩大r适用范围。本标准的附
2、录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、辽宁省疾病预防控制中心、浙江省医学科学院、北京市营养源研究所。本标准主要起草人：王竹、杨晶明、张旭、马景宏、唐靓、唐华澄、王克诚。食品中泛酸的测定GBT 50092 1 020081范围本标准规定了食品中泛酸的测定方法。本标准适用于食品中泛酸的测定。本标准的检出限：食品，当称样量为5 g时，检出限为250 pg门00 g；营养素补充剂等，当称样量为1 g时，检出限为200Lg100 g。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准
3、的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。(；HT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，1SO 3696：1987，MOD)3原理泛酸是植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(ATcc 8014)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，植物乳杆菌的生长响应与培养基中泛酸含量呈线性关系。用比浊法测定试样液中细菌增殖后的混浊度，通过与标准曲线相比较计算出试样中泛酸的含量。4试剂除另有说明
4、外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GBT 6682规定的二毂水。41冰乙酸(C!HtOz)。42三水合乙酸钠(c。H。02Na3H：o)。43氢氧化钠(NaOH)。44盐酸(HCl)。4；5 三羟甲基氨基甲烷Tri(hydroxymethyl)aminomethane，c4H11N03。46碳酸氢钾(KHCOa)。47碳酸钠(NazCOs)。48磷酸氢二钾(K。HP04)。4 9磷酸二氢钾(KH。PO，3HeO)。41 0硫酸镁(MgSOt7H 20)。411氯化钠(NaCl)。412硫酸亚铁(FeSOt7H?()。413硫酸锰(MnSOnH。O)。414无水乙醇(C。H eO)。4 15 D
5、owex 1X8”，200目400目。1) 由Fluck公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GBT 50092 1 02008416碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)”。417鸽子肝脏丙酮提取物(1iver acetone powder)”。418 D泛酸钙(C18H。：CaN：O。)：纯度98。419葡萄糖(c。H，。O。)。420蛋白胨(peptone)。421酵母提取物(yeast extract)。422琼脂。423甲苯(C，H。)。424溴麝香草酚蓝(【1 zt
6、H!sBr：O。s)：指示剂。4 25溴甲酚绿(C。H。Br。()。S)：指示剂。426乙酸溶液(o2 motI。)：吸取118 rnI。冰乙酸(41)，加水稀释至l 000 mL。4 27 乙酸钠溶液(0 2 molI。)：称取272 g三水合乙酸钠(42)，加水溶解并稀释至l 000 ml。428氧氧化钠溶液(1 molL)：称取4 0 g氢氧化钠(43)，加水溶解并稀释至100 mI。429氢氧化钠溶液(0】molI，)：称取04 g氢氧化钠(43)，加水溶解并稀释至100 mI。430盐酸溶液(1 molI，)：吸取83 mI。盐酸(44)，用水稀释至1 000 ml，。431 Tri
7、s缓冲液：称取】21 g三羟甲基氨基甲烷(45)溶于500 mI。水中，用冰乙酸(41)调pH至8083，加水至1 000 mI，贮存于24冰箱中，可保存两周。432生理盐水：称取9 g氯化钠(411)溶于1 000ml。水中。临用前，取生理盐水分装于2支4支试管中，每支约加1 0 m1，塞好棉塞，于1 2l高压灭菌10 rain后备用。433乙醇溶液(1+4)：量取200 mI无水乙醇(414)与800mI。水混匀。434碳酸钠溶液(o08 molI，)：称取085 g碳酸钠(47)，加水溶解并稀释至1 OO mI。435碱性磷酸酶溶液：称取2 g碱性磷酸酶(416)加水溶解并稀释至100
8、mI。临用现配，用前24冰箱冷藏。436碳酸氢钠溶液(o02 molL)：称取1 g碳酸氢钾(46)，加水溶解并稀释至500 mI。混匀。437活化DowexlX8：称取100 gDowexlX8(415)于锥形瓶中，加入，盐酸溶液(430)于振荡器上充分振摇10 min，用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。再加入1 L盐酸溶液重复振摇、过滤。加入1 I。水振摇10rain过滤，用水洗涤Dowexlx810次。逐滴加入Tris缓冲液(431)调节DowexlX8 pH至80。2 I：4冰箱保存，两天内用完。438鸽子肝脏提取液：配制此试剂前一天将所用容器放人24冰箱中冷藏过夜。4381 称取30 g鸽子
9、肝脏丙酮提取物(4 1 7)放人冷的研钵中，冰浴条件下分两次加入300 mL碳酸氢钾溶液(436)研磨至匀浆，转入预冷的具塞离心管中，盖好塞后充分振摇。一20冷冻10 min后以3 000 rmin离心5 min，将上清液转至500 ml，预冷的广口瓶中。4382加150 g活化Dowex】X8(，37)，放入冰浴中振摇5 min，将混合液倒人离心管中，3 000 rmin离一0 5 min。将上清液移八另500 mI。预冷的广口瓶中，一20冷冻10 min。4 383重复4382步骤操作一次。将上清液分装于具塞试管中(每管大约3 mI。)，20冷冻保存。用前化冻并保存于24冰箱内直至用时。4
10、 39泛酸标准储备液(40，0 ggmI。)：精确称取435 mg预干燥至恒重的D一泛酸钙(418)于l 000 mI，容量瓶中，用约500 mI，水溶解，加入1 0 mI。乙酸溶液(426)，1 00 mI乙酸钠溶液(427)，用水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯(423)于24冰箱中贮存两年。2) 由Sigma公剐提供的产品。给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GBT 50092 1 02008440泛酸标准中间液(100 pgmI。)：准确吸取250 ml。泛酸标准储备液(439)置于1 000 mI。容量瓶中，
11、加入10ml，乙酸溶液(426)，】OomL乙酸钠溶液(427)，用水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯(423)于24冰箱中贮存一年。441 泛酸标准工作液(o020 p-gm1)：准确吸取200 mI。泛酸标准中间液(440)置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。此标准工作液现用现配。442溴麝香草酚蓝溶液：称取01 g溴麝香草酚蓝(424)于研钵中，加16 ml，01 mol1氢氧化钠溶液(429)研磨，加少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250 mI。此指示剂变色终点为草绿色(pH 68)。443溴甲酚绿溶液：称取0 1 g溴甲酚绿(425)于小研钵中，加14 mI。01 moll。氢
12、氧化钠溶液研磨(429)，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250 mI。此指示剂变色终点为草绿色(pH 45)。444 甲盐溶液：分别称取25 g磷酸氢二钾(48)和25 g磷酸二氢钾(49)，加水溶解并稀释至500 mI。加入3滴5滴甲苯，24冰箱可保存一年。445乙盐溶液：分别称取lO g硫酸镁(410)、05 g氯化钠(411)、05 g硫酸亚铁(41 2)和05 g硫酸锰(41 3)，加水溶解并稀释至500 mL。加5滴盐酸(44)，24冰箱保存一年。446基础培养液：可按附录A配制泛酸测定用基础培养液。也可直接由试剂公司购买泛酸培养基干粉(pantothenate medi
13、um)”，用前根据需要量按说明书配制，效力相当。447菌种储备用琼脂培养基：按表l各成分用量称取或吸取后，加水至100 mI，沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用1 moil，盐酸溶液(430)调节指示剂呈草绿色(pH 68)，如过量用i molI氢氧化钠溶液(428)回调pH至68。尽快分装于试管中，每管3 mL5 mI。，视试管内径粗细而定，液面高度不得低于2 CD3。塞上棉塞，121高压灭菌10 min，取出后直立放置，待冷却后于冰箱内保存。表1 菌种储备用培养基配制一览表试剂 用量葡萄糖 1 0 g蛋白胨 08 g酵母提取物 02 g三水台乙酸钠 1 7 g甲盐溶
14、液 0 2 mL乙盐溶液 0 2 ml。琼脂 1 2 g5仪器和设备51天平：感量01 1339。52电热恒温培养箱：37l。53压力蒸汽消毒器。54旋涡混匀器。55离心机。3) 由)ifco公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GBT 50092 1 0200856振荡器。57接种针和接种环。58 pH计：精度001。59分光光度计。510超净工作台。6菌种的制备与保存61菌种：植物乳杆菌Lactohacillus plantaruDl(ATCC 8014)。62储备菌种的制备：将植物乳杆菌Ltob
15、a cillus plantarum(AFCC 801 4)菌种接种于菌种储备用琼脂培养基(447)中，在37l恒温箱中培养16 h24 h，取出后放入24冰箱中保存。至少每隔7 d传种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，需在使用前每天接种一次，连续传代2次3 7欠后方可使用，以增加细菌活力，提高细菌的灵敏度。63接种液的制备：试验前一天，取2 mL泛酸标准工作液和3 mI。基础培养液混合分装于两支lo mI。离心管中，塞好棉塞，于12】高压灭菌10 rain后即为种子培养液。将培养1 6 1124 h的植物乳杆菌L“oba cill“s plantarum(ATCC 801
16、4)储备菌种转种至两支种子培养液中，于37l恒温培养箱中培养1 6 h2011。取出后3 000 rrain离心10min，弃上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗两次，3 000 rrain离心10 rain，弃上清液。再加入3 mI。灭菌生理盐水，混匀后立即使用。7测定步骤所有操作均需避光进行。71试样提取711 食品(包括各类食品及以食物为基质的营养强化食品和保健食品)7111 水解：准确称取适量试样至100 mI，锥形瓶中(精确至000l g)，使泛酸含量大致在50 pg200 Pg。一般固体试样称取2 g5 g；液体试样称取s g10 g；营养强化或保健食品试样称取03 g2 g。加10 m
17、I。7Iris缓冲液(431)、30 mI。水，混匀。于1 21高压条什下水解15 rain。冷却至室温转移至1 OO mI，容量瓶中，用水定容至刻度(V。)，过滤。7112酶解：吸取10m1水解液(U)于25 mI，具塞刻度试管底部，在冰浴条件下，分别小心加入预冷的01 ml。碳酸氢钠溶液(435)、04 mL碱性磷酸酶溶液、02 mI鸽子肝脏提取液和04 mI。水。分别小心混匀每个试管，避免混合物粘附于试管壁，加1滴甲苯，371温箱中培养过夜(4 h以上)。加水至20 mI，以溴甲酚绿溶液为外指示剂，用冰乙酸调节pH至45，加水定容至250 mI，(V。)，过滤。7113调节pH值：吸取适
18、量的澄清酶解液(20 m1。1 00 mIV)于25 mL具塞刻度试管中，以溴麝香草酚蓝溶液为外指示剂用0】molI。氧氧化钠溶液(429)调节pH至68，用水定容至250 mI，(V。)。根据试样中泛酸含量必要时用水对斌样提取液进1f稀释(L厂)，使稀释后试样提取液中泛酸浓度在002”gmI。003 119mI，范围内。7114酶空白液：另取一试管分别加入10 mI。Tris缓冲液、0 1 mI，碳酸氢钠溶液、04 mI。碱性磷酸酶溶液、02 mI鸽子肝脏提取液和04 mI。水混匀后于37L温箱中培养过夜。以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用01 motI，氢氧化钠溶液调节pH至6 8，加水定容至2
19、50 m1，即为酶空白液。712营养素补充剂、强化剂、维生素预混料等固体准确称取0300 g1000 g液体准确吸取30 mL1 00 mI。转入1()o n1L锥形瓶中加入乙醇溶液(1+4)80 mI，振摇提取过夜(4 h以上至试样完拿溶解)，用水定容至1 oO n1I，(V)。根据试样中泛酸含量用水对进行适当稀释(f)，使稀释后溅样提取液中泛酸浓度在002 lgmI，003 pgmL范围内。GBT 50092 1 0200872测定管制备721 试样管和酶空白管：取四支试管，分别加入1o mI，、20 mI3 0 mI4 o mI，试样酶解液(Vs)或酶卒白液(v。)，补水至体积为5 0
20、IllI。，再加入50 mI。基础培养液(4 46)，混匀。722标准系列管：分别吸取泛酸标准工作液00 ml，、10 mI，、20 mI3 0 mI4 0 mL、50 mI。于试管中，相当于标准系列管中泛酸含最为0 0 pg、0020 pg、0040 pg、0060 tlg、0080 pg、0100 pg泛酸。加水至50 mI。，再加人50 mI，基础培养液(446)，混匀。为保证标准曲线的线性关系，至少应制备两套标准系列管绘制标准线时，以每点的均值计算。73培养731灭菌：将所有测定管塞好棉塞，f 1 21高压灭菌10 rain。732接种和培养：待试管冷却至室温后，在无菌操作条件下，每管
21、接种一滴接种液。置于371恒温培养箱中培养1 6 h20 h，直至达到最大混浊度，即再培养2 h透光率变化不超过2。另准备一支标准管(含0o pg泛酸)不接种作为对照。74测定将培养好的试样管、酶空白管、标准系列管用旋涡混匀器混匀。用厚度为l cm比色杯，在640 nnl处，以未接种的标准管调节透光率为100，然后依次测定标准系列管、试样管和酶空白管的透光率。如果接种后标准系列管中的0管透光率在90以下，或与未接种的标准管相比标准系列管透光率最大变化量在40以下时，说明有杂菌或不明来源的泛酸混入，需重做实验。75结果计算以标准系列管泛酸含量为横坐标、透光率为纵坐标，绘制标准曲线。从标准曲线查得
22、试样管和酶空白管中泛酸的相应含量，如果每个试样的四支试样管中有两支以上泛酸含量在002 pg01 Pg范围内，则町继续进行结果计算，否则需重新取样测定。食品试样首先按式(1)计算酶空白液中泛酸含量，然后按式(2)计算试样中泛酸含量。7n，25，、72 2i?一 ”t 1)式中：m 酶空白液中泛酸含量，单位为微克(pg)；从标准曲线上查得酶空白管中泛酸含量，单位为微克(pg)；25 一酶空白液总体积，单位为毫升(mI。)；v。、制备酶空白管时吸取的酶空白液体积，单位为毫升(mL)。Xm。V 畿(2)式中：x试样中泛酸含鼍，单位为毫克每百克(nag100 g)； 从标准曲线r查得试样管中泛酸含量，
23、单位为微克(pg)；v。 制备试样管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升(m1。)；V。 试样稀释液的定容体积，单位为毫升(nI，)；v4试样稀释时吸取的酶解液体积，单位为毫升(mI。)；Va试样酶解液的定容体积，单位为毫升(mI山，一试样稀释倍数：m酶空白液中泛酸含量单位为微克(pg)；V-试样水解液的定容体积，单位为毫升(m1)；m2试样质量，单位为克(g)；yz试样酶解时吸取的水解液体积，单位为毫升(ml山5GBT 50092102008丽100由微克每克(pgg)换算为毫克每百克(mg100 g)的系数。营养素补充剂、强化剂、维生素预混料等试样按式(3)计算泛酸含量。 x一鬻揣式中：X一
24、试样中泛酸含量单位为毫克每百克(mg100 g)；m。 从标准曲线上奁得试样管中泛酸含量，单位为微克(gg)；V，一一试样水解液的定容体积，单位为毫升(mI，)；，试样稀释倍数：m试样质量，单位为克(g)；Ve制备试样管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升(m1)5r1丽00石、_由微克每克(pgg)换算为毫克每百克(mg门oo g)的系数。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的l 5。(3)A1试剂附录A(资料性附录)泛酸测定用基础培养液的配制方法GBT 50092102008A11不含维生素的酪蛋白(vitamin free casein)。A12盐酸(H
25、CI)。A13盐酸溶液：3 molI。l mol1，。A14氢氧化钠(NaOH)溶液：10 molI。，l molI。A15活性炭。A16硫酸腺嘌呤(C”Hc)N，。H zSO。)。A17盐酸鸟嘌呤(【1jH。N。O。HCl)。A18尿嘧啶(C；H。Nz02)。A19 I。胱氨酸(C。H。：N20。S，)。A110 l。色氨酸或DI。一色氨酸(C。，H，。N。O：)。A111核黄素(C。H 2。N40s)。A112盐酸硫胺素(C。：H，C1N。OSHCI)。A11 3生物素(C】oH，sN20。s)。A114乙酸(C2H。02)溶液：002 toolL。A115对氨基苯甲酸(C，H，NO。)。
26、A116尼克酸(C6H sN02)。A117盐酸吡哆醇(CsH。NO。HCI)。A118无水乙醇(C2H 60)。A119乙醇溶液(1 4-3)。A120聚山梨酯80(吐温80)。A121无水葡萄糖(C。H。：O。)。A122三水合乙酸钠(C2 H。O。Na3H zo)。A123甲苯(C，H8)。A124溴酚蓝(c。H，。Br。O：s)溶液：称取01 g溴酚蓝，用少量无水乙醇(A118)溶解后，用乙醇稀释至100 mL。此指示剂变色终点为草绿色(pH 35)。A125溴麝香草酚蓝(C2，H zsBrz05s)溶液：按442配制。A126酸解酪蛋白液：称取50 g不含维生素的酪蛋白(A11)于5
27、00 mL烧杯中，加200 mI，3 molL盐酸溶液(A13)，于121高压水解6 h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200 m1水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以除去盐酸。以溴酚蓝溶液作外指示剂，用10 molI。氢氧化钠溶液(A14)调节pH值至指示剂颜色转为草绿色(pH 35)。加20 g活性炭(A15)，振摇约20 min，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至1 000 mI。，加1 mI。3 mI。甲苯(A123)，置24冰箱中可保存一年。注：每次蒸发时不可蒸于或焦糊，以避免所含营养素破坏。A127腺嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶溶液：分别称取硫酸
28、腺嘌呤(A16)、盐酸鸟嘌呤(A17)和尿嘧啶(A18)各01 g于250 mL烧杯中，加75 mI。水和2 mL盐酸(A12)，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至100 mL，加CUr 50092 1 O一20083滴5滴甲苯贮：存于棕色试剂瓶中置24冰箱中可保存一i二。A128 胱氨酸色氨酸溶液：分别称取4 g I。胱氨酸(A19)和1 g I，色氨酸或2 g DI，色氨酸A 110)于800m【水巾-加热至7()80，逐滴加入3molI。盐酸溶液(A13)，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷却至窄温后加水稀释至】000 mI
29、。加3滴5滴甲苯，旷存于棕色试剂瓶中，于24 o(冰箱中可保存一年。A 129维生素液I：分别称取20 mg核黄素(A1】1)和l 0 mg盐酸硫胺素(A11 2)，加入1 0 n1L生物素溶液(40 fzgfm。)，用002 mol,1。乙酸溶液(A114)溶解并定容至1 000 mI。加人3滴j滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，24冰箱可保存一年。A130维生素液11：分别称取l()mg对氨基苯甲酸(A 1 1 5)、50 mg尼克酸(A 11 61和40 mg盐酸吡哆醇(A1 1 7)，溶于l 000 mI。乙醇溶液(A119)中。加入3滴5滴甲苯舻仔于棕色试剂瓶中。24冰箱叮保存一二。A13
30、1 聚山梨酯一80溶液：将25 g聚114梨酯80(A120)川乙醇(A11 8)溶解并稀释至250 mI。24冰箱可保存一年。A132甲盐溶液；按444配制。A133乙盐溶液：按445配制。A2基础培养液配制250 mI。基础培养液按表A1各成分用量吸取液体试剂，混合后加水1 50 mI。，依次加入固体试剂，煮沸搅拌2 Hun。以溴麝香草酚蓝溶液为外指示剂，用10 molI，或1 mol!。氧氧化钠溶液调节基础培养液pI值直至指示剂变为草绿色(pH 68)；如果指示剂变蓝说明加入的氢氧化钠溶液过量，以1 moIl，盐酸溶液回调指示剂至草绿色。加入乙盐溶液5mI。，用水补至250mI。24冰箱内可保存7 d。配制时可根据基础培养液用量按比例增减。表A1 泛酸测定用基础培养液配制一览表试剂 用量 试剂 用量酸解酪蛋白液 2j mL 聚山梨酯80溶液 0 25 n1I，液体试剂腺嘌呤鸟嘌呤屎畴啶溶液 5 0 mI。甲盐溶液 j o n、I，液体试剂 维生素溶液 5 0 mIJ维生素溶液 5 0 n1L无水葡萄糖 1 0 g固体斌剂胱氡酸色氨酸溶液 25 mL 王水合乙酸钠 8 3 g
