1、lCS 67040C 53 a园中华人民共和国国家标准GBT 50092 11200820081 I-21发布食品中叶酸的测定Determination of folates in foods2009-03-0 1实施中华人民共和国卫生部世士中国国家标准化管理委员会及仰刖 罱GBT 50092112008本标准修改采用国际分析家学会(A()AC INTERNATIONAI。)中AOAC 94412维生素预混料中叶酸的测定(Folic acid in vitamin preparations)。本标准与AOAC 94412相比主要差异为：增加了，普通食品试样提取步骤；扩大了适用范围。本标准的附录
2、A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、辽宁省疾病预防控制中心、浙江省医学科学院、北京市营养源研究所。本标准主要起草人：王竹、杨晶明、张旭、马景宏、唐靓、李跃中、王克诚。食品中叶酸的测定GBT 500921 120081范围本标准规定了食品中叶酸的测定方法。本标准适用于食品中叶酸的测定。本标准的检出限：普通食品，当称样量为5 g时，检出限为2 pg100 g；营养素补充剂、强化剂及预混料当称样量为1 g时，检出限为2 Fg100 g。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引
3、用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理01酸是细菌生长所必需的营养素，在一定控制条件下，细菌的生长响应与培养基中叶酸含量呈线性关系。用比浊法测定试样液中细菌增殖后的混浊度，通过与标准曲线相比较计算出试样中叶酸的含量。4试剂除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GBT 6682规定的二级水。4
4、1 甲苯(CH。)。42磷酸钠(Na。PO；1 2H：()。43磷酸氢二钠(Na!HPO。7H?O)。44抗坏血酸(C。H。O。)。45无水乙醇(C=H6()。46氢氧化钠(NaOH)。47盐酸(HCl)。48鸡胰酶(chicken pancrease)”。49木瓜蛋白酶(papain)”。410淀粉酶(taka diastase)”。411 叶酸(C。H1。NMO)：纯度98。412葡萄糖(C。H：O。)。413蛋白胨(peptone)。41 4酵母提取物(yeast extract)。1) 由Difco公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等
5、效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2) 由Sigma公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1GBT 50092112008415琼脂。416磷酸氢二钾g100 g)(2)GBT 500921 12008m。一从标准曲线上查得试样管中叶酸含量，单位为纳克(ng)；v。制备试样管时吸取的试样液体积，单位为毫升(mL)；v。试样提取液定容体积，单位为毫升(mL)；，试样液稀释倍数；。，鸡胰酶液或(和)蛋白酶一淀粉酶液中叶酸含量，单位为纳克(ng)；m试样质量，单位为克(g)；器由纳克每克(ngg
6、)换算为微克每百克(pg10。g的系数。注：营养素补充剂、强化剂及预混料等试样提取步骤中因无酶解处理，故无需计算酶空白液中叶酸含量，即式(2)中m10。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15。GBT 500921 12008A1 测定附录A(资料性附录)叶酸标准储备液浓度的测定准确吸取10mI。标准储备液至10mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液(o1molL)定容至刻度。以氢氧化钠溶液(o1 m。lL)调零点，比色杯厚度1 cm，波长256 nm，用紫外分光光度计测定三次吸光度值，取平均值。A2计算按式(A1)计算标准储备液叶酸浓度。c一鲁M10103 式中：
7、c标准储备液中叶酸浓度，单位为微克每毫升(pgmL)万平均吸光度值；E摩尔消光系数，24 500；M叶酸相对分子质量，44142；10稀释倍数；10。由克每升换算为微克每毫升的换算系数。(A1)B1试剂附录B(资料性附录)叶酸测定用基础培养液的配制方法GBT 500921 12008B11无水乙醇(CzHsO)。B12不含维生素的酪蛋白(vitamin free casein)。B13碳酸氢钠(NaHCOs)。B14碳酸氢钠(NaHCO。)溶液：01 molL。B15盐酸(HCI)。B16盐酸溶液：3 molI，1 molL。B17氢氧化钠(NaOH)溶液：10 molI，1 molL。B18
8、胰酶(pancreatin)。B19甲苯。B110硅藻土。B111冰乙酸(C。HO。)。B112乙酸溶液：002 molL。B113活性炭。B114硫酸腺嘌呤(C-。H，。N-oH。SO。)。B115盐酸鸟嘌呤(C；H。N sOsHCl)B116尿嘧啶(C4H4N202)。B117黄嘌呤(C5H4Nt02)。B118氨水(NH。O)。B119三水合乙酸钠(CzH。OzNa3H20)。B120核黄素(C。，Hz。NtOe)。B121 生物素(C。H16N203s)。B122对氨基苯甲酸(C，H，NOz)。B123盐酸吡哆醇(Cs H。NOsHCI)。B124盐酸硫胺素(CtzH，clNaOSHC
9、l)。B125泛酸钙(Cl 8H3zCaN2010)。B126尼克酸(CsHsNOz)。B127聚山梨酯一80(吐温80)。B128还原型谷胱甘肽(C”H。，N。O。S)B129 L天冬氨酸(CaH，NOt)。B130 L色氨酸(C11H1 2N202)。B131 I。一盐酸半胱氨酸(C。H，NO。SHCI)。B132无水葡萄糖(C。H。：O。)。B133溴麝香草酚蓝(cz，HzsBrzO。s)溶液：按435配制。B134溴酚蓝(c。H。Br。o；s)溶液：01 g100 mL，无水乙醇(B11)配制。此指示剂变色终点为草绿色(pH 35)。B135酪蛋白液：可按下列任一种方法制备。7GBT
10、50092112008B1351酶解酪蛋白液：称取50 g不含维生素的酪蛋白(B12)至1 L烧杯中，慢慢加入1 I，碳酸氢钠溶液(B14)：以防止结块，用10moII，氢氧化钠溶液(B17)调节pH值至80。加入300 mg胰酶(B18)，搅拌20rain，使胰酶充分混匀。加入25mL甲苯(B19)，置37l恒温培养箱中酶解48 h72 h。从恒温培养箱中取出酪蛋白酶解液，于121高压30 rain以终止反应，冷却至室温。加入10 g硅藻土(B110)，搅拌均匀，用布氏漏斗过滤，滤液用约60mI冰乙酸(B111)调节pH值至37。称取1 2 g活性炭(B113)，加入滤液中准确搅拌10 ra
11、in，用铺有10 g硅藻土的布氏漏斗过滤，滤液从“称取12 g活性炭”开始重复操作两次。最终滤液用水稀释至1 200 mL。取10 mL酶解酪蛋白液于平皿中150烘干至恒重，如固体含量40 mgmL，则弃除酪蛋白液，重新制备。制备好的酪蛋白液加1 mI，3 mL甲苯(B19)，24冰箱冷藏保存一年。B1352酸解酪蛋白液：称取50 g不含维生素的酪蛋白(B12)于500 mI。烧杯中，加200 mL盐酸溶液(B16)，于121高压水解6 h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200 mL水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复三次，以除去盐酸。以溴酚蓝(B134)作外指示剂，用10 m
12、olI。氢氧化钠(B17)调节pH值至指示剂颜色转为草绿色(pH 35)。加20 g活性炭(B11 3)，振摇约20 rain，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至1 000 mI，加1 mL3 mL甲苯，置24冰箱中保存一年。注：每次蒸发时不可蒸干或焦糊，以避免所含营养素破坏。B136腺嘌呤一鸟嘌呤尿嘧啶溶液。分别称取硫酸腺嘌呤(B114)、盐酸鸟嘌呤(B115)以及尿嘧啶(B116)各01 g于250 mL烧杯中，加75 mI。水和2 mL盐酸(B15)，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复直至冷却后无沉淀产生为止，加水至100 rnI。
13、加3滴5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，置24于冰箱中可保存一年。B137黄嘌呤(C。HtN。0。)溶液：称取04 g黄嘌呤(B11 7)，加10 ml，氨水(B118)，加热溶解，加水至100 mL。加3滴5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，24冰箱保存一年。B138乙酸缓冲液(16molI，pH 45)：称取63 g三水合乙酸钠(B119)，用200mI。水溶解，加大约20 mI。冰乙酸(B111)，调节pH至45，混合后，用水稀释至500 mI。B139维生素液：称取100 mg核黄素(B1_20)用400 mI乙酸缓冲液(B138)溶解。取25 nag碳酸氯钠(B13)溶解于500 mL水中，加
14、入2 mg生物素(B121)、200 mg对氨基苯甲酸(B122)、400 mg盐酸吡哆醇(B123)、40 mg盐酸硫胺素(B124)、80 mg泛酸钙(B125)、80 mg尼克酸(B126)溶解。将上述溶液混合，加水至1 000 mI。加入3滴5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，24冰箱保存一年。B140聚山梨酯80(吐温一80)溶液：将10 g聚山梨酯一80(B】27)溶于无水乙醇(B11)中并稀释至100 mL，24冰箱保存。B141 还原型谷胱甘肽(c，。H-，N。0。s)溶液：称取01 g还原型谷胱甘肽(B128)，加100 mL水溶解，贮于棕色瓶中，24冰箱保存。B142甲盐溶液：按
15、433配制。B143乙盐溶液：按434配制。B2基础培养液配制250 mL基础培养液，按表B1吸取液体试剂，混合后加水l 50 mI，依次加人固体试剂，煮沸搅拌2 rain。以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用1 toolL氢氧化钠溶液调节基础培养液pH值，直至指示剂变为草绿色(pH 68)；如果指示剂变蓝说明加入的氢氧化钠溶液过量，以1 toolI。盐酸溶液回调pH值至68。加入乙盐溶液5 mL，用磷酸缓冲液(423)补至250 mI。24冰箱内可保存7 d。配制时可根据基础培养液用量按比例增减。8表B1 叶酸测定用基础培养液配制一览表GBT 50092112008试 剂 用 量 试 剂 用 量酪蛋白液 50 mI。 L一天冬氨酸 015 g腺嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶溶液 5 0 mI。 L-盐酸半胱氨酸 010 g固体液 黄嘌呤溶液 12533L I，色氨酸 010 g试体 维生素液I 25 mI。 剂 无水葡萄糖 10g试剂 聚山梨酯一80溶液 025 mI。 三水合乙酸钠 10g甲盐溶液 5 0 mL还原型谷胱甘肽溶液 卜25 mI。9
