1、ICS 67040C 53 a雪中华人民共和国国家标准GBT 50092 1 22008贝类中腹泻性贝类毒素的测定Determination of diarrhetic shellfish poison in shellfish200811-21发布 2009-03-0 1实施中华人民共和国卫生部告士中国国家标准化管理委员会及仲刖 舌GBT 50092122008本标准修改采用日本厚生省环乳第37号通知腹泻陀贝类毒素检验方法。本标准与日本厚生省方法相比主要差异为：增加r“规范性引用文什”、“术语和定义”；增加了“仪器和设备”；对“试样保存与制备”、“试剂和材料”进行r修改；在“结果判断及表述”
2、规范r结果表述方式。本标准由中华人民共和国卫生部提出井归j。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位：中华人民共和闺辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、王秋艳、于杰、于兵、黄大亮、孙哲平、宋惠君、郑惠芳、丁健、薛忠良、徐维加、郑秋月。贝类中腹泻性贝类毒素的测定1 范围本标准规定了贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的测定疗法。，本标准适用子贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的测定。2规范性引用文件GBT 50092 122008下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注H期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均
3、不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。(；BT 6682分析实验室用水规格和试验力_法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)GB 14925实验动物环境及没施3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31腹泻性贝类毒素diarrhetic shellfish poinson；DSP以大田软海绵酸(okadaic acid，OA)及其衍生物为代表、摄食后可产生以腹泻为主要特征的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称。32鼠单位fflouse unit；MU对体重为16 g20
4、g的三只雄性1CR小鼠腹腔各注射1 mI。贝类毒素提取液后，使两只或三只小鼠在24 h内死亡的最低毒素量定义为一个鼠单位。4原理用丙酮提取贝类中DSP毒素，经乙醚分配后，经减压蒸于，再以含1吐温一60的生理盐水为分散介质，制备DSP 1吐温60生理盐水混悬液，将该混悬液注射人小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。5试剂和材料除非另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GBT 6682规定的一级水。5 1 丙酮(C。H。()。52无水乙醚(bH。()。53 1吐温60的生理盐水：称取10 g吐温60(CsHmO。s)，溶于生理盐水(085氯化钠)中，并定容至1000 i11I，。6仪器和设
5、备61旋转蒸发器。62圆底烧瓶：500 mI、250 mL、100 mL、50 mI，。63均质器。1GBT 5009212200864布氏漏斗。6，5天平：感量01 g。66带塞刻度试管：】5 nI。具02 mI。刻度。67分液漏斗。68冰箱。69一次性注射器：1 mI。610小白鼠：体重为16 g-20 g的健康ICR品系雄性小鼠。7试样保存和制备71样品的保存7，11样品应有充分的代表性。去壳呗肉、带壳贝类或罐装贝类样品等，均应采取足够的数量并使贝肉达400 g以上。712不能及时送检的样品，除可常温保存的样品外，应将样品置于合成树脂袋内冷冻送检。如为带壳样品，应按72的方法开壳，去除水
6、分后冷冻送检。7，2样品的制备721 生鲜带壳样品的前处理用清水彻底洗净贝类外壳，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他异物取出贝肉。严禁以加热或药物方法开壳。注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺(又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色)。将去壳贝肉放在孔径约2 rlqrl2的金属筛网上，沥水5 rllin，按723制备检样。722冷冻样品的前处理在室温下使冷冻样品融化呈半冷冻状态。带壳冷冻的样品按721方法清洗、开壳、淋洗取肉，此时的贝肉仍呈冷冻状态，除去贝肉外部附着的冰片，用吸水纸轻轻抹去水分后，按7 23制备检样；事先已去除水分的冷冻去壳样品，室温融化后，按723制备检样。72
7、3检样制备对于可以切取中肠腺的贝类(扇贝、贻贝及牡蛎等)，称量200 g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后作为检样备用，注意不要使中肠腺内容物污染制样工具；不便切取中肠腺的贝类样品，称量200 g贝肉后，可将全部贝肉细切后混合，作为检样。8检验步骤81试样提取811 将检样置于均质杯中，加三倍量丙酮后均质2 min以上。立为小均质杯，可分两次操作。812将均质好的物质倒人布氏漏斗中抽滤，收集滤液。8，13对残渣分别用残渣两倍量的丙酮再清洗两次滤液与8 12滤液合并。814将滤液移人500 mI的圆底烧瓶中，561下，减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物。815用100 mI，20
8、0 mI。乙醚溶解油状物，倒人分液漏斗内再用少量的乙醚清洗圆底烧瓶，合并倒入分液漏斗内，以少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡(不能生成乳浊液)，静置分层后去除水层(下层)。8，16用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次。再将乙醚层移人250 rnI。或500mI，的圆底烧瓶中。于35。(-1减压浓缩去除乙醚。817用少量乙醚将浓缩物移人50 mI，或100 mI。圆底烧瓶中再次减压浓缩去除乙醚。818 以1吐温60的生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10 mI，充分振摇，制成均匀DSPl吐温一60生理盐水混悬液。此时1 mI，溶液中相当于含有20 g贝肉，以此悬浮液作为试验原液。GBT 50092
9、122008进行动物实验。819 以试验原液注射小鼠，24 h内两只或二三只小鼠死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射小鼠。稀释前膻先振荡使斌液成均匀悬浮液，再取其部分以1吐温60生理盐水稀释。82小白鼠试验82 1选择l 6 g20 g健康ICR雄性小鼠六只，随机分为实验组和空白对照组(1吐温60生理盐水)两组，每组三只。822待测液(试验原液或其稀释液)混匀后。分别取1 m1。待测液或1吐温60生理盐水腹腔注射动物。注射过程中若有一滴以r提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射完毕至小鼠停止呼吸死亡的时间，来死亡的应连续观察24 h。82 3观察日_限24 h内，在空白对
10、照组小鼠正常的情况下，实验组若出现两只或j只小鼠死亡，则应按表1进行最小染毒量动物实验或最大稀释度实验。表1 注射量与毒力的关系试验液 注射量，mI。 检样量5，g 毒力(MUg)原液 10 20 0 05原液 0 5 10 0 14倍稀释液 1 0 024倍稀释液 0 5 2 S 0 41 6倍稀释液 1 0 I 2j 0 81 6倍稀释液 0 5 0 625 1 68以中肠腺为检样时，相当下台有中肠腺的去壳肉量。824注意事项：腹泻性贝类毒素是一类剧毒的混合物，为避免腹泻性贝类毒素对健康的危害，实验过程自始至终应戴手套操作。橡胶手套、玻璃制品等用过的器材应在5的次氯酸钠溶液中浸泡1 h以上方可清洗或丢弃。同样，废弃的提取液等也应以上述溶液浸泡后处理。小鼠尸体应按GB 14925要求焚烧处理，其排放物应达到污物焚烧排放规定要求。9结果计算和表述91 观察时限24 h内，在空白对照组小鼠正常的情况下，若实验组无小鼠死亡或仅有一只小鼠死亡，则报告受检样品中DSP毒力为：d005 MUg。92观察时限24 h内，在空白对照组小鼠正常的情况下，若实验组有两只或三只小鼠死亡，则按823进行动物实验，并根据表1计算待检样品中DSP毒力，报告该样品的毒力为：MUg。
