1、ICS 67.040 C 53 B 中华人民共和国国家标准GB/T 5009.22-2003 代替GB/T5009. 22-1996 食品中黄曲霉毒素B，的测定Determination of aflatoxin B, in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员百GB/T 5009.22-2003 前言本标准代替GB/T5009. 22一1996(食品中黄曲霉毒素队的测定方法儿本标准与GBjT5009.22-1996相比主要修改如下修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中黄曲霉毒素队的测定h按照GBjT20001. 42
2、001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改，本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由中国预防医学科学院营养及食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草。178 本标准第二法由卫生部食品卫生监督检验所、北京市营养源研究所负责起草。本标准第二法主要起草人z计融、路戈、罗雪云、张镜、王键伟。本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。GB/T 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定1 范围本标准规定了粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素队的测定方法。本标准适用于粮食、花生及其
3、制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素队的测定。在第法中，薄层板上黄曲霉毒素队的最低检出最为0.0004问，检出限为5g/kg。第二法对黄曲霉毒素BI的检出限为0.01g/kgo第一法2 原理试样中黄曲霉毒素BI经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。3 试押l3.1 三氯甲烧。3.2 正己烧或石油隧(沸程30C600C或60C90C)。3.3 甲醇。3.4苯。3.5 乙脯。3.6 元水乙酷或乙隧经无水硫酸纳脱水。3.7 丙酬。以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸
4、。3.8 硅胶G:薄层色谱用。3.9 三氟乙酸。3.10 元水硫酸锅。3.11 氯化锅。3.12 苯-乙脯混合液:量取98mL苯，加2mL乙脯，混匀。3.13 甲醇水溶液:55+45。3.14 黄曲霉霉素B，标准溶液3.14.1 仪器校正z测定重错酸饵溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准确称取25mg 经干燥的重错酸惆(基准级)，用硫酸(0.5+1 000)溶解后并准确稀释至200mL，相当于c(K2Cr2 0，)二O. 000 4 mol/L 0再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加硫酸(0.5十1000)稀释至刻度，相当于O.000 2 mol/L溶液。再吸取25mL此稀
5、释液于50mL容量瓶中，加硫酸(0.5+1000)稀释至J度，相当于O.000 1 mol/L溶液。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波长(接近350nm处)用硫酸(0.5+1000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度，并按式(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。179 GB/T 5009.22-2003 E, =主C ( 1 ) 式中zE，一一重错酸饵溶液的摩尔消光系数FA一一测得重错酸愣溶液的吸光度sc一-重络酸饵溶液的摩尔浓度。再以此平均值与重错酸饵的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素，按式(2)进行计算。山-EfJ . ( 2 ) 式中zf 使用仪器
6、的校正因素$E一一测得的重错酸梆摩尔消光系数平均值。若f大于0.95或小于1.05.则使用仪器的校正因素可略而不计。3.14.2 黄曲霉毒素B，标准溶液的制备z准确称取1mg1. 2 mg黄曲霉毒素B，标准品，先加人2mL 乙脯溶解后，再用苯稀释至100mL.避光，置于40C冰箱保存。该标准溶液约为10g/mLo用紫外分光光度汁测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。结果计算:黄曲霉毒素B，标准溶液的浓度按式(3)进行计算。AX晶1X1000 X f x= ( 3 ) E, 式中-X一一黄曲霉毒素B，标准溶液的浓度，单位为微克每毫升g/mL); A一一测得的吸光度值gf 使用仪器的校
7、正因素，M 黄曲霉毒素队的分子量312，Z一一黄曲霉毒素队在苯一乙膀混合液中的摩尔消光系数198000根据计算，用苯乙脯混合液调到标准溶液浓度恰为10.0g/mL.并用分光光度计核对其浓度。3.14.3 纯度的测定=取5L10g/mL黄曲霉毒素B，标准榕液，滴加于涂层厚度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇三氯甲烧(4+96)与丙酣三氯甲烧(8+92)展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，应符合以下条件=3.14.3.1 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。3.14.3.2 原点上没有任何残留的荧光物质。3.15 黄曲霉毒素B，标准使用液E准确吸取1mL标准溶液(10g/mLJ于1
8、0mL容量瓶中，加苯乙腊混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0何黄曲霉毒素息。吸取1.0 mL此稀释液，置于5mL 容量瓶中，加苯-乙脯混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2吨黄曲霉毒素B，o再吸取黄曲霉毒素B，标准溶液(0.2g/mLJ1.0 mL置于5mL容量瓶中，加苯乙脯混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.04g黄曲霉毒素B，o3.16 次氯酸钩溶液(消毒用)，取100g漂白粉，加人500mL 水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸销(Na, C03 lOH，O)溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25 g/Lo若用漂粉精制备，则碳酸纳的
9、量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10 g/L次氯酸钩溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸销溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。4 仪器4.1 小型粉碎机。4.2 样筛。4.3 电动振荡器。4.4 全玻璃浓缩器。4.5 玻璃板:5cmX 20 cm。4.6 薄层板涂布器。4.7 展开槽2内长25cm、宽6cm、高4Cffio 4.8 紫外光灯:100W125 W.带有波长365nm滤光片。4.9 微量注射器或血色素吸管。5 分析步骤5.1 取样GB/T 5009.22-2003 试样中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样
10、带来的误差，应大量取样，并将该大量试样粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果，因此采样应注意以下几点。5. 1. 1 根据规定采取有代表性试样。5. 1. 2 对局部发霉变质的试样检验时，应单独取样。5. 1. 3 每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至o.5 kgl kg.然后全部粉碎。粮食试样全部通过20日筛，混匀。花生试样全部通过10目筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等试样不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批试样可采取3份大样作试样制备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定的代表性。5.2 摄取5.2.1 玉米、
11、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等5.2. 1. 1 甲法g称取20.00g粉碎过筛试样(面粉、花生酱不需粉碎).置于250mL具塞锥形瓶中，加30 mL iE己统或石油隧和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于4g试样)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL 三氯甲烧，振摇2min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烧层，经盛有约10 g预先用三氯甲烧湿润的无水硫酸铀的定量慢速滤纸过滤于
12、50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲炕于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烧层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烧洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风桓于650C水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2min,_3 min后，准确加入1mL苯-乙脯混合液(或将三氯甲烧用浓缩蒸馆器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯-乙脯混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。5.2. 1. 2 乙法(限于玉米、大米、小麦及其制品):称取20.00g粉碎过筛试样于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加
13、约6mL水，使试样湿润，准确加入60mL三氯甲烧，振荡30min.:!m 12 g无水硫酸锅，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中。取12mL滤液(相当4g试样)于蒸发皿中，在65C水浴上通风挥干，准确加人1mL苯乙腊混合液，以下按5.2. 1. 1自用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合起依法操作。5.2.2 花生泊、香油、菜油等称取4.00g试样置于小烧杯中，用20mL iE己统或石油隧将试样移于125mL分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇
14、水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烧，以下按5.2. 1. 1自振摇2min，静置分层.起依法GB/T 5009.22-2003 操作。5.2.3 酱油、醋称取10.00g试样于小烧杯中，为防止提取时乳化，加0.4g氯化俐，移入分液漏斗中，用15mL三氯甲烧分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中。以下按5.2.1.1自振摇2min，静置分层起依法操作，最后加入2.5mL苯-乙脯混合液，此溶液每毫升相当于4g试样。或称取10.00g试样，置于分液漏斗中.再加12mL甲醇(以酱油体积代替水，放甲醇与水的体积比仍约为55+45).用20mL三氯甲烧
15、提取，以下按5.2.1. 1自振摇2min，静置分层起依法操作。最后加入2.5mL苯乙腊混合液。此溶液每毫升相当于4g试祥。5.2.4 干酱类(包括豆鼓、腐乳制晶)称取20.00g研磨均匀的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加人20mL正己;皖或石油隧与50mL 甲醇水溶液。振荡30mn，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24mL甲醇水层(相当8g试样，其中包括8g干酱类本身约含有4mL水的体积在内)置于分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烧，以下按5.2.1.1自振摇2min，静置分层.起依法操作。最后加入2mL苯乙腊混合液。此溶液每毫升相当于4g试样。5.2.5 发酵酒
16、类同5.2.3处理方法，但不加氯化锅。5.3 测定5.3.1 单向展开法5.3.1.1 薄层板的制备z称取约3g硅胶G.加相当于硅胶量2倍3倍左右的水，用力研磨1min ,-._ 2 min至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5cmX20 cm，厚度约0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在1000C活化2h.取出，放干燥器中保存。一般可保存2天3天，若放置时间较长，可再活化后使用。5.3.1.2 点样3将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点问距约为1cm.点直径约3mmo在同一块板上滴加点的大小
17、应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下=第一点:10L黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mLl。第二点:20L样液。第三点:20L撑液+10L0.04g/mL黄曲霉毒素B，标准使用液。第四点:20L样液十10LO. 2g/mL黄曲霉毒素B，标准使用液。5.3.1.3 展开与观察z在展开槽内加10mL无水乙酶，预展12cm.取出挥干。再于另一展开槽内加10 mL丙阁-三氯甲烧(8+92).展开10cm12 cm.取出。在紫外光下观察结果，方法如下。5. 3. 1. 3. 1 由于样液点上加滴黄曲霉毒素B，标准使用液，可使黄曲霉毒素B，标准点与样液中的黄曲霉毒素B，荧光点重叠。如
18、样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B，为0.0004月，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B，最低检出量是否正常出现才日为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B，为0.002月，主要起定位作用。5.3. 1. 3. 2 若第二点在与黄曲霉毒素B，标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示试样中黄曲霉毒素B】含量在5g/kg以下;如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。5.3. 1. 4 确证试验为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B，产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B，的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在O.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点:0.04g/mL黄曲
19、霉毒素B，标准使用液10Lo第二点:20L样液。于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于400C.再于薄层板上滴加以下两个点。182 第三点，0.04g/mL黄曲霉毒素B，标准使用液10L。第四点，20L样液。GB/T 5009.22-2003 再展开(同5.3.l. 3)，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B，标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。5.3. 1. 5 稀释定量=样液中的黄曲霉毒素B，荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B，标准点的最低检出量(0.0004g)的荧
20、光强度一致，则试样中黄曲霉毒素B，含量即为5g/kgo如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下z第一点，10L黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mU。第二点:根据情况滴加10L样液。第三点z根据情况滴加15L样液。第四点=根据情况滴加20L样液。5.3. 1. 6 结果计算2试样中黄曲霉毒素队的含量按式(4)进行计算。V , X D 1000 X = 0.000 4 X-云一一一一( 4 ) ， m 式中zX一一试样中黄曲霉毒素队的含量，单位为微克每千克(g/kg); k一
21、-加入苯-乙脯混合液的体积，单位为毫升(mU，V，一一出现最低荧光时滴加样液的体积，单位为毫升(mL);D一一-样液的总稀释倍数pm一一-加入苯-乙脯混合液溶解时相当试样的质量，单位为克(g);0.000 4一黄曲霉毒素队的最低检出量，单位为微克(g)。结果表示到测定值的整数位。5.3.2 双向展开法如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素队的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用元水乙隧作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B，不动，然后再用丙酣三氯甲统(8+92)作纵向展开，试样在黄曲霉毒素B，相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴
22、加两点法展开仍有杂质干扰时，则可改用滴加一点法。5.3.2.1 i葡加两点法5.3.2.1.1 点样取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉素B，标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘。.8cm，._，lcm处各滴加10L黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mU，在距左边缘2.8 cm3 cm 处各滴加20L样液，然后在第二块板的样液点上加滴10L黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mU，在第三块板的样液点上加滴10LO. 2g/mL黄曲霉毒素B，标准使用液。5.3.2.1.2 展开5. 3. 2. 1. 2. 1 横向展开:在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好
23、的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开1次2次。5.3.2. 1. 2. 2 纵向展开=挥干的薄层板以丙阁-三氯甲炕(8+92)展开至10cm-12 cm为止。丙酣与三氯甲饶的比例根据不同条件自行调节。5.3.2.1.3 观察及评定结果5.3.2. 1. 3. 1 在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B，标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，贝tl试样中黄曲霉毒素B，含量183 GB/T 5009.22-2003 在5g/kg以下。5. 3. 2. 1. 3. 2 若第一板在与第二板的相
24、同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素战标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时做，也可按照顺序做。如按顺序傲，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略，如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接作第二板。5. 3. 2. 1. 4 确证试碰另取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘。.8cm，._，lcm处各滴加10L黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mLl及1小滴三氟乙酸F在距左边缘2.8cm-3 cm处，于第四板滴加20L祥液及1小滴三氟乙酸g于第五板滴加20L样液、10L黄曲霉毒素B，
25、标准使用液(0.04g/mU及1小滴三氟乙酸，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40C。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B，标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B，含量高时，则将样液稀释后，按5.3. 1. 4做确证试验。5.3.2.1.5 稀释定量如样液黄曲霉毒素B，含量高时，按5.3. 1. 5稀释定量操作。如黄曲霉毒素B，含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。5.3.2. 1. 6 结果计算同5.3. 1. 6 0 5.3
26、.2.2 商加一点法5.3.2.2.1 点样z取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B，标准使用液与样液。即在三块板距左边缘。.8cm.l cm处各滴加20L样液，在第二板的点上加滴10L黄曲霉毒素鼠标准使用液(0.04g/mLl，在第三板的点上加滴10L黄曲霉毒素B，标准溶液(0.2g/mL)。5.3.2.2.2 展开:同5.3. 2. 1. 2的横向展开与纵向展开。5.3.2.2.3 观察及评定结果:在紫外光灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的黄曲霉毒素B，标准点，而第一板与其相同位置上未出现荧光点，试样中黄曲霉毒素B，含量在5g/kg以下。如第一板在与第二板黄曲霉毒素B
27、，相间位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与黄曲霉毒素B，标准点重叠，如果重叠再进行以下确证试验。5.3.2.2.4 确证试验z另取两板，于距左边缘。.8cm-1 cm处，第四板滴加20L样液、1滴三氟乙酸;第五板滴加20L样液、10LO. 04g/mL黄曲霉毒素B，标准使用液及1滴三氟乙酸。产生衍生物及展开方法同5.3.2.1。再将以上二板在紫外光灯下观察，以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B，标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量，如含黄曲霉毒素B，低，不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍
28、有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B，荧光的强弱，直接用双向展开法定量。5.3.2.2.5 结果计算s同5.3. 1. 6。第二法6原理试样中的黄曲霉毒素B，经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。7 试剂7.1 抗黄曲霉毒素B，单克隆抗体，由卫生部食品E生监督检验所进行质量控制。184 GBjT 5009.22-2003 7.2 人工抗原AFBl牛血清白蛋白结合物。7.3 黄曲霉毒素Bl标准溶液=用甲醇将黄曲霉毒素Bl配制成1mg/mL溶液，再用甲醇PBS溶液(20+80)稀释至约10吨/mL，紫外分光
29、光度计测定此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式(5)计算=AX品1X1000 X f X. . . ( 5 ) E 式中.X 该溶液中黄曲霉毒素Bl的浓度，单位为微克每毫升(g/mLl, A 测得的光密度值;M 黄曲霉毒素队的分子量，312，E 摩尔消光系数，21800，f一一使用仪器的校正因素。根据计算将该溶液配制成10用/mL标准溶液，检测时，用甲醇PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。7.4 三氯甲烧。7.5 甲醇。7.6 石油隧。7.7 牛血清白蛋白(BSA)。7.8 邻苯二胶OPDl。7.9 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠!gG。7.10 碳酸销。7.11 碳酸氢锅。7.12 磷酸
30、二氢例。7.13 磷酸氢二锅。7.14 氯化锅。7.15 氯化例。7.16 过氧化氢(H20，)。7.17 硫酸。7.18 ELISA缓冲液如下:7.18.1 包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液)的制备zNa,C03 1. 59 g NaHC03 2. 93 g 加蒸馆水至1000mLo 7.18.2 磷酸盐缓冲液(pH7.4PBS)的制备zKH,PO, 0.2 g Na2HPO, . 12H,O 2.9 g NaCl 8.0 g KCl 0.2 g 加蒸馆水至1000 mL。7.18.3 洗液(PBS-T)的制备:PBS加体积分数为0.05%的吐温2007.18.4 抗体稀释液的制备:BSA
31、1.0g加PBS-T至1000 mLo 7.18.5 底物缓冲液的制备如下7.18.5.1 A液(0.1mol/L拧橡酸水溶液):拧橡酸(CH, 07 H, )21. 01 g，加蒸馆水至1OOOmL。7.18.5.2 B液(0.2mol/L磷酸氢二锅水溶液):Na, HPO, 12比071.6g，:1m蒸馈水至1000 mLo 185 GB/T 5009.22-2003 7.18.5.3 用前按A液+B液+蒸馆水为24.3十25.7+50的比例(体积比)配制。7.18.6 封闭液的制备z同抗体稀释液。8 仪器8.1 小型粉碎机。8.2 电动振荡器。8.3 酶标仪，内置490nm滤光片。8.4
32、 恒温水浴锅。8.5 恒温培养箱。8.6 酶标微孔板。8.7 微量加样器及配套吸头。9 分析步骤9.1 取样同5.L 9.2 提取9.2.1 大米和小米(脂肪含量3.0%)的提取1)试样粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入60mL三氯甲烧，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30mino静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中。立即取12 mL滤液(相当4.0g试样)于75mL蒸发皿中，65C水浴通风挥干。用2.0mL 20%甲醇PBS分三次(0.8mL、0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.
33、0g试样。9.2.2 玉米的提取(脂肪含量3.0%-5.0%)试祥粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中，准确加入50.0mL甲醇水(80十20)溶液和15.0mL石油醋，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯中，从中取10.0mL(相当于4.0g 试样)于75mL蒸发皿中。以下按9.2.1自65C水浴通风挥干起依法操作。9.2.3 花生的提取(脂肪含量15.0%-45.0%)试样去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中，准确加入100.0mL甲醇-水(55+4
34、5)溶液和30mL石油隧，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30mino静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇一水溶液于100mL烧杯中，从中取20.0mL (相当于4.0g试样)置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烧，振摇2min，静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层)，放出三氯甲炕于75mL蒸发皿中。再加5.0mL三氯甲烧于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲统一并于蒸发皿中，以下按9.2.1自65c水浴通风挥干起依法操作。9.2.4 植物油的提取用小烧杯称取4.0g试样，用20.0mL石油酶，将试样移于125mL分液漏斗中，
35、用20.0mL甲醇水(55+45)溶液分次洗烧杯，溶液一并移于分液漏斗中(精炼油4.0g样为4.525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶剂后振摇)，振摇2min。静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75时，蒸发皿中，再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按9.2.1自650C水浴通风挥干起依法操作。1)脂肪含量参照食物成分表队中国预防医学科学院营养与食品E生研究所编著，1991年8月，第一版。186 GB/T 5009.22-2003 9.2.5 其他食晶的提取可按第一法5.2. 1. 1, 5. 2. 3. 5. 2. 4操作至将蒸发皿放在通风橱内于65C水
36、浴上通风挥干以下接9.2.1自用2.0mL20%甲醇PBS分三次.起，依法操作。9.3 间接竞争性酶联免瘦吸附测定(ELISA)9.3.1 包被微孔板g用AFB，-BSA人工抗原包被酶标板.150L/孔.4C过夜。9.3.2 抗体抗原反应z将黄曲霉毒素B，纯化单克隆抗体稀释后分别a) 与等量不同浓度的黄曲霉毒素B，标准溶液用2mL试管混合振荡后.4C静置。此液用于制作黄曲霉毒素B，标准抑制曲线。b) 与等量试样提取液用2mL试管混合振荡后.4C静置。此液用于测定试样中黄曲霉毒素B，含量。9.3.3 封闭己包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min后，加封闭液封闭.250L/孔，置370C下1ho
37、9.3.4 测定:酶标板洗3X3min后，加抗体抗原反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或Sp2/0培养上清液作为阴性对照)130L/孔.37 C. 2 ho酶标板洗3X3min，加酶标二抗1 200(体积分数)J100L/孔.1 h。酶标板用洗液洗5X3mino加底物溶液(10mgOPo)加25mL底物缓冲液加37L 30% H , 02 100L/孔，37 C, 15 min，然后加2mol/L H2SO,. 40L/孔，以终止显色反应，酶标仪490nm测出00值。9.4 结果计算黄曲霉毒素B，的浓度按式(6)进行计算。V , 黄曲霉毒素B，浓度(ng/g) c X X D X - .
38、( 6 ) V2 -, m 式中.c 黄曲霉毒素B，含量，单位为纳克(ng).对应标准曲线按数值插入法求，V , 试样提取液的体积，单位为毫升(mL);V2一一滴加样液的体积，单位为毫升(mL);D 稀释倍数;m一一试样质量，单位为克(g)。由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素B，浓度(c，)的单位为纳克每毫升，而测孔中加入的试样提取的体积为0.065mL.所以式(6)中c O. 065 mL X c, 而V，2mL. V，0.065 mL. D2. m二4g代人式(6).则黄曲霉毒素B，浓度(ng/g) 0.065 X c, X主一X2 X c, (ng/g) O. 065 ., - ., 4 所以，在对试样提取完全按本方法进行时，从标准曲线直接求得的数值c即为所测试样中黄曲霉毒素队的浓度(ng/g)0187
