1、ICS 67040C 53 囝园中华人民共和国国家标准GBT 5009222-2008红曲类产品中桔青霉素的测定2008-12-03发布Determination of citrinin in Monascus products2009-03-0 1实施丰翟糍翳篓发布中国国家标准化管理委员会仅19刖 蓦本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、江南大学。本标准主要起草人：李凤琴、许赣荣、李玉伟、陈蕴。GBT 5009222-20081范围红曲类产品中桔青霉素的测定GBT 5009222-2008本标准规定了
2、红曲类产品中桔青霉素的测定方法。本标准适用于红曲米、红曲红(固态、液态)、红曲发酵液和用红曲菌生产的保健食品中桔青霉素的测定。本标准对液态样品中桔青霉素的定量限为50 pgI。，对固态样品中桔青霉素的定量限为1 mgkg。2原理液态红曲类样品经乙醇提取、离心、过滤后经高效液相色谱仪(HPLC)分析；固态红曲类样品经甲苯乙酸乙酯甲酸提取、超声波萃取、离心、过滤后经HPI。C分析，外标法定量。3试剂除非另有规定，本标准中所用试剂均为分析纯。31桔青霉素(C，。H-。O。)标准品：纯度99。32乙腈(CH。CN)：色谱纯。33磷酸(H。PO。)：色谱纯。34甲醇(CH。OH)：色谱纯。35甲苯(C。
3、H。CH。)。36乙酸乙酯(C。HsO。)。37甲酸(CH：02)。38超纯水(H20)：电阻率18、3 Mncm。39无水乙醇(C：HeO)：色谱纯。310复合萃取剂(TEF)：甲苯乙酸乙酯甲酸(7+3+1)，配制方法是将7份体积的甲苯(35)、3份体积乙酸乙酯(36)和1份体积的甲酸(37)混合而成。311桔青霉素标准溶液：准确称取0005 0 g的桔青霉素标准品(31)于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成50 mgr。的桔青霉素标准储备液。取一定量的储备液用甲醇稀释lo倍，制成5 mgL的标准工作液。储备液和工作液密封后4冰箱避光保存，工作液现用现配。工作液从冰箱取出后应于室温下
4、至少放置10 rain，涡旋混匀后方可使用。将标准储备液用甲醇系列稀释后，配成质量浓度为01 mg10 25 mg1、1 mgI。、5 mgI。、10 mgI的标准工作溶液用于制作标准曲线。4仪器和设备配有荧光检测器的高效液相色谱系统。超声波细胞破碎仪。电子天平(感量0000 1 g)。pH计(精度001)。匀浆器。离心机。旋转蒸发仪。微孔有机滤膜(7L径045 prn)。，234567844444444GBT 5009222-200849数显恒温水浴锅(温度精度1)。410涡旋混匀器。411磁力搅拌器。5分析步骤51样品提取511液态红曲样品将带有菌丝体的液态发酵红曲样品匀浆后用吸量管吸取1
5、0 mL(液态红曲红样品直接取样10 ml，)，置于50 mI，具塞试管中，加入20 mI，无水乙醇，60水浴加热1 h(期间不断振摇)，冷却至室温后转人塑料离心管中，3 000 rrain离心15 rnin，上清液经045 pm滤膜过滤后进行HPLC分析。512固态红曲制品用电子天平(43)准确称取一定量固态红曲样品(色素用红曲米为2 g，用红曲菌生产的保健食品为3 g，酿酒用曲为3 g)于50 mL具塞比色管中，加入20 mL TEF溶液(310)，超声提取10 min(强度40，工作5 S，问隔5 s)，3 000 rrain离心20 rain，上清液转入50 ml，具塞试管中，残渣用1
6、5 mI，TEF溶液(310)同上述步骤再提取两次，合并三次提取上清液于50mI。具塞比色管中，40真空浓缩(47)至干后加入30 mI。甲醇溶解，经微孔有机滤膜(48)过滤后进行HPI。C分析。准确称取l g粉状红曲红或红曲黄色素样品，在磁力搅拌下缓缓加到盛有20 mL TEF溶液(31 0)的烧杯中，继续搅拌30 rain后，3 000 rrain离心20 rain，以下按固态红曲样品同样的方法自“上清液转入50 mL具塞试管中”起，依法操作。52测定521液相色谱分析条件色谱柱：c18色谱柱(150 rflr”t46 r13m，粒度5 pm)；柱温：28；流动相：乙腈(32)+水(38)
7、一35+65，水用色谱纯磷酸(33)调pH至25；流速：10 mIrain；检测器：荧光检测器，激发波长33I nm，发射波长500 nm；进样量：20 pL。522色谱分析分别将20 pI。不同质量浓度(01 mgI0 25 mgI。1 mgI。、5 mgL、10 nagL)的桔青霉素标准溶液(311)及制备后的样品溶液(51)注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以桔青霉素质量浓度与相对应的峰面积绘制工作曲线，获得线性回归方程及相关系数，以此计算样品中的桔青霉素含量。由于HPI。C分析中采用了荧光检测器，样品中的杂质对桔青霉素的出峰基本无干扰，因此一般情况下无需确证，必要时用液相色谱一质谱进行
8、确证，条件如下：a)毛细管电压：378 kV；b)锥孔电压：30 V；c)射频透镜电压：05 V；d)萃取锥孔电压：5 V；e)离子源温度：100；f)脱溶剂气温度：250；g)脱溶剂气流量：320 Lh；h)电子倍增电压：650 V；i)相对分子质量范围：100500。桔青霉素的液相色谱图参见附录A，质谱图参见附录B。76结果计算61 固态样品中桔青霉素的含量按式(1)计算式中：c，样品中桔青霉素含量，单位为毫克每千克(mgkg)r仪器检测的质量浓度，单位为毫克每升(mgI，)；V最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品质量，单位为克(g)。62液态红曲样品中桔青霉素的浓度按式(2)计算：f
9、2一f瓦Vz式中：cz液态样品中桔青霉素浓度，单位为毫克每升(ragL)c仪器检测的质量浓度，单位为毫克每升(ragL)；Vz样品定容体积，单位为毫升(mL)；V-一一移取的样品体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留两位有效数字。GBT 5009222-20087精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。(2)GBT 5009222-2008附录A(资料性附录)桔青霉素的液相色谱图A1 桔青霉素标准液相色谱图见图A1。120 00110oo100 0090 oo80oo70 oo60 oo2oo 4 oo 6 oo注：标准溶液浓度为25 mgL，注射10 p
10、L，相当于25 ng，保留时间约为1000 rain图A1 桔青霉素标准液相色谱图A2红曲样品中桔青霉素液相色谱图见图A2。160 00140 oo120oo100 oo80 002 00 4 oo 6 oo 8 oo 10 00图A2红曲样品中桔青霉素液相色谱图B1桔青霉素标准质谱图见图B1。附录B(资料性附录)桔青霉素质谱图160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420注：桔青霉素相对分子质量为250。图B1桔青霉素标准质谱图B2红曲样品中桔青霉素质谱图见图B2。图B2红曲样品中桔青霉素质谱图GBT 5009222-2008113zmz
